Mengesahkan prestasi primer dan probe pada peringkat awal reagen PCR dan menentukan keadaan tindak balas yang paling sesuai adalah prasyarat untuk memastikan kelancaran kemajuan eksperimen formal.
Jadi bagaimana kita perlu mengesahkan siasatan primer pada peringkat awal?
Penunjuk utama ialah garis dasar, lengkung amplifikasi, nilai ct, kecekapan amplifikasi, pengesanan sampel kepekatan rendah, CV, dsb.
Garis dasar
Garis dasar ialah garis mendatar dalam lengkung amplifikasi PCR.Dalam beberapa kitaran pertama tindak balas penguatan PCR, isyarat pendarfluor tidak banyak berubah dan membentuk garis lurus.Garis lurus ini adalah garis dasar.
Apabila menyaring probe primer PCR, perhatikan sama ada garis dasar adalah tahap.Ketulenan kepekatan probe primer akan menjejaskan garis dasar, seperti menyebabkan garis dasar naik atau turun.Garis dasar juga merupakan penunjuk yang sangat intuitif.
Keluk Penguatan
Penunjuk intuitif lain ialah bentuk lengkung amplifikasi.Adalah lebih baik untuk mempunyai lengkung berbentuk S untuk mengelakkan penguatan sekunder atau lengkung penguatan abnormal yang lain.
Nilai Ct
Bilangan kitaran yang sepadan dengan titik infleksi dari garis dasar kepada pertumbuhan eksponen ialah nilai Ct.
Untuk sampel yang sama, kuar primer yang berbeza menghasilkan lengkung penguatan yang berbeza, dan nilai Ct yang sepadan akan dipengaruhi oleh kecekapan penguatan dan tahap gangguan.Secara teori, lebih kecil nilai Ct probe primer yang kita pilih, lebih baik.
Kecekapan Amplifikasi
Salah satu kaedah yang paling boleh dipercayai dan stabil untuk menilai kecekapan amplifikasi PCR ialah lengkung standard, yang juga diiktiraf secara meluas oleh penyelidik.Kaedah ini melibatkan membuat satu siri sampel untuk mengawal bilangan relatif templat sasaran.Sampel ini biasanya dibuat dengan pencairan bersiri larutan stok pekat, yang paling biasa digunakan ialah pencairan 10 kali ganda.Menggunakan satu siri sampel yang dicairkan, menggunakan program qPCR standard untuk menguatkan untuk mendapatkan nilai Cq, dan akhirnya melukis lengkung piawai mengikut kepekatan setiap sampel dan nilai Cq yang sepadan untuk mendapatkan persamaan linear Cq= -klgX0+b, dan kecekapan amplifikasi E=10(-1 /k)-1.Apabila menggunakan qPCR untuk analisis kuantitatif, kecekapan amplifikasi dikehendaki berada dalam julat 90%-110% (3.6>k>3.1).
Pengesanan Sampel berkepekatan rendah
Apabila kepekatan sampel rendah, kadar pengesanan probe primer yang berbeza adalah berbeza.Kami memilih 20 sampel berkepekatan rendah untuk ditiru, dan sistem siasatan primer dengan kadar pengesanan tertinggi adalah yang terbaik.
Pekali Variasi (CV)
10 sampel pendua boleh dikesan dengan probe primer yang berbeza mengikut standard talian reagen untuk pengesanan amplifikasi asid nukleik.
Reagen Kuantitatif:
Ketepatan
Ketepatan dalam satu kelompok harus memenuhi: pekali variasi (CV,%) nilai logaritma kepekatan ujian ialah ≤5%.Apabila kepekatan sampel rendah, pekali variasi (CV,%) logaritma kepekatan pengesanan ialah ≤10%
Reagen kualitatif:
Ketepatan
Ketepatan dalam satu kelompok harus memenuhi:
(1) Pekali variasi nilai Ct (CV,%) ≤5%
Sampel yang sama diuji secara selari selama 10 kali, dan keputusan ujian harus konsisten
Masa siaran: Sep-18-2021
