PCR kuantitatif pendarfluor (juga dikenali sebagai TaqMan PCR, selepas ini dirujuk sebagai FQ-PCR) ialah teknologi kuantitatif asid nukleik baharu yang dibangunkan oleh PE (Perkin Elmer) di Amerika Syarikat pada tahun 1995. Teknologi ini berasaskan PCR konvensional dengan menambahkan probe berlabel pendarfluor.Berbanding dengan PCR fleksibel, FQ-PCR mempunyai banyak kelebihan untuk merealisasikan fungsi kuantitatifnya.Artikel ini berhasrat untuk menerangkan secara ringkas ciri, prinsip, kaedah dan aplikasi teknologi.
1 Ciri-ciri
FQ-PCR bukan sahaja mempunyai sensitiviti tinggi PCR biasa, tetapi juga kerana penggunaan probe pendarfluor, ia boleh secara langsung mengesan perubahan isyarat pendarfluor semasa penguatan PCR melalui sistem pengaliran fotoelektrik untuk mendapatkan hasil kuantitatif, yang mengatasi banyak kekurangan PCR konvensional, jadi ia juga mempunyai kekhususan tinggi teknologi hibridisasi DNA dan ketepatan tinggi spektroskopi.
Sebagai contoh, produk PCR am perlu diperhatikan dengan elektroforesis gel agarose dan pewarnaan etidium bromida dengan cahaya ultraviolet atau oleh elektroforesis gel poliakrilamida dan pewarnaan perak.Ini bukan sahaja memerlukan pelbagai instrumen, tetapi juga memerlukan masa dan usaha.Noda yang digunakan Ethidium bromide berbahaya kepada tubuh manusia, dan prosedur eksperimen yang rumit ini memberi peluang untuk pencemaran dan positif palsu.Walau bagaimanapun, FQ-PCR hanya perlu membuka penutup sekali semasa pemuatan sampel, dan proses seterusnya adalah operasi tiub tertutup sepenuhnya, yang tidak memerlukan pasca pemprosesan PCR, mengelakkan banyak kelemahan dalam operasi PCR konvensional.Percubaan secara amnya menggunakan kitar haba PCR ABI7100 yang dibangunkan oleh syarikat PE.
Instrumen ini mempunyai ciri-ciri berikut: ① Aplikasi yang luas: Ia boleh digunakan untuk kuantifikasi produk DNA dan RNA PCR, penyelidikan ekspresi gen, pengesanan patogen dan pengoptimuman keadaan PCR.② Prinsip kuantitatif yang unik: Menggunakan probe berlabel pendarfluor, jumlah pendarfluor akan terkumpul dengan kitaran PCR selepas pengujaan laser, untuk mencapai tujuan kuantifikasi.③ Kecekapan kerja yang tinggi: Kitar terma 9600 PCR terbina dalam, komputer dikawal 1 hingga 2 jam untuk melengkapkan penguatan dan kuantifikasi 96 sampel secara automatik dan serentak.④ Tidak perlu elektroforesis gel: Tidak perlu mencairkan dan elektroforesis sampel, hanya gunakan probe khas untuk mengesan terus dalam tiub tindak balas.⑤Tiada pencemaran dalam saluran paip: Tiub tindak balas tertutup sepenuhnya yang unik dan sistem pengaliran fotoelektrik diguna pakai, jadi tidak perlu risau tentang pencemaran.⑥Hasilnya boleh dihasilkan semula: julat dinamik kuantitatif adalah sehingga lima urutan magnitud.Oleh itu, sejak teknologi ini berjaya dibangunkan, ia telah dinilai oleh ramai penyelidik saintifik dan telah diaplikasikan dalam banyak bidang.
2 Prinsip dan kaedah
Prinsip kerja FQ-PCR adalah menggunakan aktiviti exonuclease 5′→3′ enzim Taq untuk menambah probe berlabel pendarfluor pada sistem tindak balas PCR.Probe secara khusus boleh menghibridkan dengan templat DNA yang terkandung dalam urutan primer.5'hujung probe dilabelkan dengan gen pancaran pendarfluor FAM (6-carboxyfluorescein, puncak pelepasan pendarfluor pada 518nm), dan hujung 3'dilabelkan dengan Kumpulan pelindapkejutan pendarfluor TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, puncak pelepasan pendarfluor'begin 582'begin daripada fosfat'begin pada 582 phosphogin'begin pada 582. probe daripada dilanjutkan semasa penguatan PCR.Apabila probe kekal utuh, kumpulan pelindapkejut menekan pelepasan pendarfluor kumpulan pemancar.Sebaik sahaja kumpulan pemancar dipisahkan daripada kumpulan pelindapkejutan, perencatan ditarik balik, dan ketumpatan optik pada 518nm meningkat dan dikesan oleh sistem pengesanan pendarfluor. Dalam fasa renaturasi, probe berhibrid dengan DNA templat, dan enzim Taq dalam fasa lanjutan bergerak sepanjang templat DNA dengan lanjutan primer.Apabila probe terputus, kesan pelindapkejutan dilepaskan dan isyarat pendarfluor dilepaskan.Setiap kali templat disalin, probe terputus, disertai dengan pelepasan isyarat pendarfluor.Memandangkan terdapat hubungan satu dengan satu antara bilangan fluorofor yang dikeluarkan dan bilangan produk PCR, teknik ini boleh digunakan untuk mengukur templat dengan tepat.Instrumen eksperimen biasanya menggunakan kitar haba PCR ABI7100 yang dibangunkan oleh syarikat PE, dan kitar haba lain juga boleh digunakan.Jika sistem tindak balas jenis tindak balas ABI7700 digunakan untuk eksperimen, selepas tindak balas selesai, keputusan kuantitatif boleh terus diberikan melalui analisis komputer.Jika anda menggunakan kitar haba lain, anda perlu menggunakan pengesan pendarfluor untuk mengukur isyarat pendarfluor dalam tiub tindak balas pada masa yang sama untuk mengira RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ mewakili nisbah keamatan pendarfluor kumpulan pelepasan pendarfluor tiub sampel kepada keamatan pendarfluor kumpulan pelindapkejutan, RQ- mewakili nisbah kedua-dua dalam tiub kosong, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) mewakili jumlah perubahan isyarat pendarfluor semasa PCR Selepas keputusan pemprosesan data boleh menjadi kuantitatif.Disebabkan pengenalan probe pendarfluor, kekhususan eksperimen bertambah baik dengan ketara.Reka bentuk probe secara amnya harus memenuhi syarat berikut: ①Panjang probe hendaklah kira-kira 20-40 tapak untuk memastikan kekhususan pengikatan.②Kandungan bes GC adalah antara 40% dan 60% untuk mengelakkan pertindihan jujukan nukleotida tunggal.③ Elakkan hibridisasi atau bertindih dengan primer.④ Kestabilan pengikatan antara probe dan templat adalah lebih besar daripada kestabilan pengikatan antara primer dan templat, jadi nilai Tm probe hendaklah sekurang-kurangnya 5°C lebih tinggi daripada nilai Tm primer.Selain itu, kepekatan probe, homologi antara probe dan jujukan templat, dan jarak antara probe dan primer semuanya mempunyai kesan ke atas keputusan eksperimen.
Produk Berkaitan:
China Masa Nyata PCR Easyᵀᴹ-Taqman Pengeluar dan Pembekal |Foregene (foreivd.com)
Masa siaran: 15-Okt-2021
