1. Mengesan penyerapan larutan RNA
Penyerapan pada 280, 320, 230, dan 260 nm mewakili nilai asid nukleik, latar belakang (kekeruhan larutan), kepekatan garam, dan bahan organik seperti protein, masing-masing.Secara amnya hanya lihat OD260/OD280 (Nisbah, R).Apabila 1.8~2.0, kami berpendapat bahawa pencemaran protein atau bahan organik lain dalam RNA boleh diterima, tetapi perlu diperhatikan bahawa apabila Tris digunakan sebagai penampan untuk mengesan penyerapan, nilai R mungkin lebih besar daripada 2 (umumnya ia sepatutnya <2.2).Apabila R<1.8, pencemaran protein atau bahan organik lain dalam larutan lebih jelas, dan nasib RNA boleh ditentukan mengikut keperluan.Apabila R>2.2, ia bermakna RNA telah dihidrolisiskan kepada asid nukleik tunggal.
2. Corak elektroforesis RNA
Secara amnya, gel denaturasi digunakan untuk elektroforesis RNA, tetapi jika ia hanya untuk mengesan kualiti RNA, gel denaturing tidak diperlukan, dan gel agarose biasa boleh digunakan.Tujuan elektroforesis adalah untuk mengesan integriti jalur 28S dan 18S dan nisbahnya, atau integriti sapuan mRNA.Secara amnya, jika jalur 28S dan 18S adalah terang, jelas dan tajam (merujuk kepada tepi jalur adalah jelas), dan kecerahan 28S adalah lebih daripada dua kali ganda berbanding jalur 18S, kami menganggap kualiti RNA adalah baik.
Di atas adalah dua kaedah yang biasa kami gunakan, tetapi kedua-dua kaedah ini tidak dapat memberitahu kami dengan jelas sama ada terdapat baki RNase dalam larutan RNA.Sekiranya terdapat sejumlah kecil RNase dalam larutan, sukar untuk kita mengesannya dengan kaedah di atas, tetapi kebanyakan tindak balas enzimatik berikutnya dilakukan pada suhu di atas 37 darjah dan untuk masa yang lama.Dengan cara ini, jika terdapat sejumlah kecil RNase dalam larutan RNA, maka akan ada persekitaran dan masa yang sangat sesuai untuk memainkan peranan mereka dalam eksperimen seterusnya, dan sudah tentu eksperimen akan menjadi sejuk pada masa ini.Di bawah ini kami memperkenalkan kaedah yang boleh mengesahkan sama ada terdapat residu RNase dalam penyelesaian RNA.
3. Ujian pemeliharaan haba
Mengikut kepekatan sampel, lukis dua 1000 ng RNA daripada larutan RNA dan tambahkannya ke dalam tiub empar 0.5 ml, dan tambahkannya dengan penimbal pH 7.0 Tris kepada jumlah isipadu 10 ul, dan kemudian tutup penutup tiub itu.Letakkan salah satu daripadanya dalam tab mandi air bersuhu tetap pada 70°C dan biarkan ia hangat selama 1 jam.Bahagian lain disimpan dalam peti sejuk -20°C selama 1 jam.Apabila masa tamat, keluarkan dua sampel untuk elektroforesis.Selepas elektroforesis selesai, bandingkan jalur elektroforesis kedua-duanya.Jika jalur kedua-duanya konsisten atau tidak mempunyai perbezaan yang ketara (sudah tentu jalur mereka juga memenuhi syarat dalam kaedah 2), ini bermakna tiada pencemaran RNase sisa dalam larutan RNA, dan kualiti RNA adalah sangat baik.Sebaliknya, jika sampel yang diinkubasi pada 70 ° C menunjukkan kemerosotan yang jelas, ia menunjukkan bahawa terdapat pencemaran RNase dalam larutan RNA.
2 Kaedah dan teknik eksperimen untuk pengekstrakan RNA
Masalah yang sering kita hadapi semasa mengekstrak RNA ialah: (1) hasil RNA adalah rendah;(2) RNA mempunyai pencemaran garam yang serius;(3) RNA mempunyai pencemaran pelarut organik yang serius;(4) kemerosotan sampel dan masalah lain
1. Jumlah reagen pengekstrakan RNA yang biasa digunakan
Kaedah guanidine isothiocyanate dan kaedah Trizol adalah kaedah yang paling biasa digunakan untuk pengekstrakan jumlah RNA daripada tisu haiwan dan sel haiwan.Ia amat sesuai untuk sampel kecil dan tisu yang amat sukar untuk diekstrak, seperti pengekstrakan jumlah RNA daripada kulit arnab dan tisu penghubung haiwan;sebagai tambahan, Trizol, sebagai reagen lisis tujuan umum, juga boleh digunakan untuk pengekstrakan tisu tumbuhan, bakteria, kulat dan tisu lain.Untuk tisu tumbuhan yang mengandungi polisakarida dan polifenol, seperti camellia oleifera, daun teh, biji sesawi, dsb., kaedah CTAB juga boleh digunakan untuk mengekstrak jumlah RNA.
Sebagai kaedah konvensional, kaedah dua lajur juga sangat popular kerana operasi suhu biasa, tidak perlu menambah RNase, dan keselamatan-tiada kloroform, fenol dan reagen organik lain untuk pengekstrakan.(produk yang disyorkan )
2. Pengekstrakan jumlah RNA daripada tisu haiwan
(1) Cuba pilih tisu segar, jika ia tidak segar (sebaik-baiknya dalam tempoh tiga bulan - peti sejuk 80 ℃ atau beku dalam nitrogen cecair. Apabila memotong tisu, jangan potong terus pada suhu bilik, pastikan letakkan di atas kotak ais, cuba elakkan pembekuan dan pencairan berulang.
(2) Gunakan gunting dan pinset yang bersih untuk memotong sekeping kecil tisu, cuba potong bahagian tengah tisu semasa memotong sampel, atau mula-mula potong sekeping tisu besar dari tengah, dan kemudian potong sampel pada kedudukan hirisan segar.Tisu yang dibuang hendaklah dicincang sepenuhnya, masukkan tisu yang dicincang ke dalam tiub EP tanpa RNase, tambah lysate, tisu yang dicincang harus didedahkan sepenuhnya kepada lysate, dan bersedia untuk homogenisasi.
(3) Untuk tisu biasa, pilih tisu bersaiz kacang hijau (30-60 mg) untuk penghomogenan.Jika tisu mengandungi sejumlah besar protein, lemak atau tisu berserabut padat seperti hati, sewajarnya menambah atau mengurangkan jumlah tisu yang dipotong (pilihan) Pilih 10~20 mg).
(4) Jika otot ikan, daging udang, obor-obor dan tisu-tisu lain yang mempunyai kandungan air yang tinggi diekstrak, jumlah sampel perlu ditingkatkan dengan sewajarnya (disyorkan 100-200 mg).
(5) Jika keadaan membenarkan, tisu haiwan boleh diekstrak terus selepas dihomogenkan dengan penghomogen tisu laluan tinggi, jika tiada peralatan sedemikian.
(6) RNA yang diperoleh selepas pengekstrakan akhir mesti diletakkan di atas kotak ais dengan segera untuk mengurangkan degradasi RNA.
3. Pengekstrakan RNA sel haiwan
(1) Sel penggantungan: sentrifuge terus dan buang medium, basuh dengan PBS steril selama 1-2 kali, kemudian gantung dengan jumlah PBS yang sesuai, dan kemudian tambah lysate untuk lisis.Jangan tambah lysate terus ke sel yang dimendakan selepas membuang cecair sepenuhnya.Ini akan menyebabkan bungkusan histon dilepaskan selepas sel-sel yang dilisekan pada lapisan luar melekat pada bahagian luar sel yang dimendakan, dengan itu mengehadkan sentuhan sel-sel di dalam pelet dengan lisat., mengakibatkan lisis sel tidak lengkap dan mengurangkan hasil RNA.
(2) Sel-sel yang separa melekat atau tidak melekat dengan ketat: Selepas membuang medium, basuh dengan PBS selama 1-2 kali, kemudian terus menyerap jumlah PBS yang sesuai dan meniup hidangan kultur dengan pipet atau pistol untuk meniup sel, dan memindahkannya ke sel bebas RNA.Tambah lysate ke dalam tiub EP enzim untuk pengekstrakan.
(3) Sel-sel melekat: perlu dicerna dengan tripsin terlebih dahulu, kemudian dikumpulkan ke dalam tiub EP bebas RNase, disentrifugasi untuk mengeluarkan supernatan, dibasuh 1-2 kali dengan PBS untuk mengeluarkan trypsin yang berlebihan, dan digantung semula dengan jumlah PBS yang sesuai Kemudian teruskan ke langkah pengekstrakan.
4. Pengekstrakan RNA tumbuhan
Tisu tumbuhan kaya dengan sebatian fenolik, atau kaya dengan polisakarida, atau mengandungi beberapa metabolit sekunder yang tidak dikenal pasti, atau mempunyai aktiviti RNase yang tinggi.Bahan-bahan ini digabungkan dengan ketat dengan RNA selepas lisis sel untuk membentuk kompleks tidak larut atau mendakan koloid, yang sukar dibuang.Oleh itu, apabila kita mengekstrak tisu tumbuhan, kita perlu memilih kit untuk tumbuhan.Lisat dalam kit boleh menyelesaikan masalah mudah pengoksidaan polifenol dan pemisahan sebatian polisakarida dan asid nukleik.
(Untuk pengekstrakan RNA tumbuhan polifenol polisakarida, produk yang disyorkan:
(1) Kulit, pulpa, biji, daun, dsb. tumbuhan hendaklah dikisar sepenuhnya dalam mortar.Semasa proses pengisaran, nitrogen cecair perlu diisi semula dalam masa untuk mengelakkan mencairkan sampel.Sampel tanah hendaklah ditambah dengan cepat pada lisat dan digoncang untuk mengelakkan degradasi RNA.
(2) Bagi sampel yang kaya dengan serat seperti daun padi dan gandum, jumlah pengekstrakan harus dikurangkan dengan sewajarnya, jika tidak, pengisaran dan lisis tisu tidak akan lengkap, mengakibatkan hasil RNA yang diekstrak yang rendah.
(3) Untuk tisu tumbuhan yang mempunyai kandungan air yang tinggi, seperti buah delima, buah tembikai, buah pic, dan lain-lain, saiz sampel perlu ditingkatkan dengan sewajarnya (100-200 mg adalah pilihan).
(4) Tisu tumbuhan, seperti daun tumbuhan, rizom, buah-buahan keras dan bahan-bahan lain secara amnya disyorkan untuk menggunakan nitrogen cecair untuk mengadun bahan-bahan dalam mortar dengan teliti, dan kemudian meneruskan ke langkah pengekstrakan.Penghomogen tisu konvensional mungkin tidak berkesan dalam menghomogenkan tisu tumbuhan, dan secara amnya tidak disyorkan.
5. Langkah berjaga-jaga untuk pengekstrakan RNA
(1) Sampel tisu hendaklah segar mungkin untuk mengelakkan pembekuan dan pencairan berulang.
(2) Tisu hendaklah dikisar sepenuhnya semasa pengekstrakan, dan jumlah tisu tidak boleh terlalu sedikit, apatah lagi terlalu banyak.
(3) Masa pengeraman yang mencukupi perlu diberikan selepas menambah lysate untuk melisiskan sampel sepenuhnya.
(4) Apabila menggunakan kaedah Trizol untuk pengekstrakan, prinsip menyerap supernatan selepas stratifikasi adalah "lebih suka menyedut kurang daripada menyedut lebih banyak", dan tidak boleh mengekstrak ke lapisan tengah, jika tidak, ia akan menyebabkan pencemaran DNA genomik yang serius.
(5) Apabila mencuci, cecair pencuci hendaklah menyusup sepenuhnya di sekeliling dinding tiub untuk memastikan pencucian yang menyeluruh.
(6) Untuk kaedah pengekstrakan lajur, sebagai tambahan kepada memisahkan lajur selepas mencuci, lajur penjerapan juga harus diletakkan di dalam bangku ultra-bersih dan ditiup selama 5-10 minit untuk menyejat sepenuhnya pelarut organik kepada kekeringan.
(7) Pada elusi terakhir kaedah lajur, selepas menambah air DEPC, ia hendaklah diinkubasi selama 3-5 minit, atau air DEPC hendaklah dipanaskan hingga 60°C terlebih dahulu untuk meningkatkan hasil elusi.Dalam kaedah pembelahan Trizol tradisional dan kaedah pemendakan isopropanol, RNA akhir dibubarkan dalam air DEPC, jadi masa yang sesuai harus diberikan untuk pembubaran, dan bahagian bawah tiub emparan hendaklah ditiup secara berterusan dengan hujung pipet.
3 Three Punca dan penyelesaian untuk kepekatan RNA rendah/kualiti buruk
1. Hasil terlalu rendah
Sampel yang diekstrak terlalu rendah, jumlah keseluruhan tidak mencukupi, atau sampel yang diekstrak terlalu banyak dan lisis tidak lengkap;tisu atau sel yang berkualiti harus digunakan untuk pengekstrakan, pra-rawatan sampel mesti dilakukan dengan baik, dan lisis harus mencukupi.
2. Sisa genom
Apabila mengekstrak melalui kaedah Trizol, apabila supernatan disedut ke dalam lapisan tengah selepas lapisan, pencemaran genom yang serius akan disebabkan;penjagaan tambahan perlu diambil semasa melapis untuk mengelakkan menghisap ke dalam lapisan tengah.Jika kaedah lajur digunakan untuk pengekstrakan, kit yang mengandungi DNase I boleh dipilih untuk pengekstrakan.Asid nukleik yang terserap pada membran dicerna secara langsung dengan DNase I, yang boleh mengurangkan sisa DNA dengan banyak.
3. Kemerosotan RNA
Ia mungkin kemerosotan sampel yang diekstrak itu sendiri, atau kemerosotan yang disebabkan semasa proses pengekstrakan;seboleh-bolehnya, sampel segar hendaklah digunakan untuk pengekstrakan RNA, dan sampel yang dikumpul hendaklah disimpan dalam nitrogen cecair atau peti sejuk -80°C tepat pada masanya, dan pembekuan dan pencairan berulang harus dielakkan.Petua bebas RNase/DNase, tiub emparan dan bahan lain harus digunakan dalam proses pengekstrakan RNA.Proses pengekstrakan harus secepat mungkin.RNA yang diekstrak hendaklah diletakkan di atas kotak ais dan disimpan pada -80 dalam masa.Jika RNA yang diekstrak perlu dikesan oleh elektroforesis gel, elektroforesis perlu dilakukan sejurus selepas pengekstrakan, dan penimbal elektroforesis perlu diganti dengan yang baru disediakan.
4. Garam dan sisa pelarut organik
Reagen pengekstrakan mengandungi garam fenol dan guanidin, dan larutan pencuci mengandungi etanol.Semasa proses pengekstrakan, lysate tidak diserap sepenuhnya dan dibuang, dan larutan pencuci tidak dikeringkan sepenuhnya.Baki garam dan pelarut organik berbahaya kepada transkripsi terbalik dan PCR berikutnya.Tahap perencatan yang berbeza, jadi lisat tisu harus dikeluarkan sepenuhnya semasa proses pengekstrakan, dan pencucian hendaklah mencukupi supaya dinding sekeliling tiub boleh dibasuh.Di samping itu, tiub dikosongkan dan ditiup adalah langkah yang perlu, yang akan mengurangkan lagi sisa bahan organik.
Untuk maklumat lanjut tentang pengekstrakan RNA, sila ikuti laman web kami:
www.foreivd.com untuk maklumat lanjut.
Masa siaran: Dis-01-2022
