PCR ialah teknologi penguatan asid nukleik yang paling banyak digunakan dan digunakan secara meluas kerana kepekaan dan kekhususannya.Walau bagaimanapun, PCR memerlukan denaturasi haba berulang dan tidak dapat menyingkirkan batasan bergantung pada instrumen dan peralatan, yang mengehadkan penggunaannya dalam ujian lapangan klinikal.

Sejak awal 1990-an, banyak makmal telah mula membangunkan teknologi penguatan suhu malar yang tidak memerlukan denaturasi haba.Kini mereka telah membangunkan teknologi penguatan isoterma gelung pengantara, teknologi penguatan isoterma penggantian helai, teknologi penguatan isoterma bulatan bergolek, dan pergantungan jujukan asid nukleik.Teknologi penguatan isoterma dan teknologi lain. 

Lamplifikasi isoterma pengantara oop

Prinsip amplifikasi adalah berdasarkan fakta bahawa DNA berada dalam keadaan keseimbangan dinamik pada kira-kira 65°C.Apabila mana-mana primer berpasangan asas dan dilanjutkan ke bahagian pelengkap DNA untai dua, untaian yang lain akan tercerai dan menjadi untai tunggal.

Pada suhu ini, DNA menggunakan 4 primer khusus untuk bergantung pada polimerase DNA anjakan helai untuk membuat sintesis DNA anjakan helai beredar sendiri secara berterusan.

Mula-mula tentukan 6 kawasan tertentu F3, F2, F1, B1, B2, B3 pada gen sasaran, dan kemudian reka 4 primer berdasarkan 6 kawasan khusus ini (seperti ditunjukkan dalam rajah di bawah):

Primer dalam hadapan (FIP) terdiri daripada F1c dan F2.

Primer dalam ke belakang (BIP) terdiri daripada B1c dan B2, dan TTTT digunakan sebagai pengatur jarak di tengah.

Primer luar F3 dan B3 masing-masing terdiri daripada kawasan F3 dan B3 pada gen sasaran.

Dalam sistem tindak balas LAMP, kepekatan primer dalam adalah beberapa kali ganda daripada primer luar.Primer dalam mula-mula digabungkan dengan helai templat untuk mensintesis helai pelengkap untuk membentuk helai ganda DNA.Selepas itu, primer luar digabungkan dengan helai templat untuk membentuk helai ganda DNA.Di bawah tindakan polimerase BstDNA, helai pelengkap yang disintesis oleh primer dalam dilepaskan.Selepas beberapa siri tindak balas, untaian pelengkap akhirnya membentuk untaian DNA tunggal dengan struktur dumbbell.

Helai tunggal DNA struktur dumbbell itu sendiri digunakan sebagai templat untuk terus membentuk DNA struktur gelung batang peralihan dengan hujung terbuka.Primer dalam dan luar membimbing DNA struktur gelung batang peralihan untuk terus menjalani tindak balas anjakan dan lanjutan helai, dan akhirnya membentuk berbilang struktur gelung batang dengan panjang yang berbeza.campuran DNA.

Kebaikan dan keburukan penguatan isoterma pengantara gelung

Kelebihan LAMP:

(1) Kecekapan amplifikasi tinggi, yang boleh menguatkan 1-10 salinan gen sasaran dengan berkesan dalam masa 1 jam, dan kecekapan amplifikasi adalah 10-100 kali ganda daripada PCR biasa.

(2) Masa tindak balas adalah pendek, kekhususan adalah kuat, dan tiada peralatan khas diperlukan.

Kekurangan LAMP:

(1) Keperluan untuk primer sangat tinggi.

(2) Produk yang dikuatkan tidak boleh digunakan untuk pengklonan dan penjujukan, tetapi hanya boleh digunakan untuk penghakiman.

(3) Oleh kerana sensitiviti yang kuat, ia mudah membentuk aerosol, menyebabkan positif palsu dan menjejaskan keputusan ujian.

Samplifikasi anjakan trand

Penguatan anjakan helai (SDA) ialah teknik penguatan DNA isoterma in vitro berdasarkan tindak balas enzimatik yang pertama kali dicadangkan oleh sarjana Amerika Walker pada tahun 1992.

Sistem asas SDA termasuk endonuklease sekatan, polimerase DNA dengan aktiviti anjakan helai, dua pasang primer, dNTP, dan ion kalsium dan magnesium serta sistem penimbal.

Prinsip penguatan anjakan helai adalah berdasarkan urutan pengecaman endonuklease sekatan yang diubah suai secara kimia pada kedua-dua hujung DNA sasaran.Endonuclease membuka jurang dalam DNA untai di tapak pengecamannya, dan polimerase DNA memanjangkan jurang 3′ End dan menggantikan untaian DNA seterusnya.

Helai tunggal DNA yang diganti boleh digabungkan dengan primer dan dilanjutkan menjadi helai berganda oleh polimerase DNA.Proses ini diulang secara berterusan, supaya urutan sasaran diperkuatkan dengan cekap.

Kebaikan dan keburukan teknologi penguatan anjakan helai

Kelebihan SDA:

Kecekapan amplifikasi adalah tinggi, masa tindak balas adalah pendek, kekhususan adalah kuat, dan tiada peralatan khas diperlukan.

Kekurangan SDA:

Produk tidak seragam, dan beberapa produk untaian tunggal dan untaian dua sentiasa dihasilkan dalam kitaran SDA, dan ekor pasti akan berlaku apabila dikesan oleh elektroforesis.

Ramplifikasi bulatan olling

Penguatan bulatan bergolek (RCA) dicadangkan dengan menggunakan kaedah penyalinan DNA daripada organisma patogen dengan bulatan bergolek.Ia merujuk kepada penggunaan DNA bulat untaian tunggal sebagai templat pada suhu malar, dan polimerase DNA khas (seperti Phi29) ) Di bawah tindakan sintesis DNA bulatan bergolek untuk mencapai penguatan gen sasaran.

RCA boleh dibahagikan kepada amplifikasi linear dan amplifikasi eksponen.Kecekapan RCA linear boleh mencapai 10⁵kali, dan kecekapan RCA eksponen boleh mencapai 10⁹kali.

Pembezaan mudah, seperti yang ditunjukkan dalam rajah di bawah, penguatan linear a hanya menggunakan 1 primer, penguatan eksponen b mempunyai 2 primer.

RCA linear juga dipanggil RCA primer tunggal.Primer mengikat DNA bulat dan dilanjutkan oleh tindakan polimerase DNA.Produk ini adalah helai tunggal linear dengan sebilangan besar urutan berulang beribu-ribu kali panjang gelung tunggal.

Memandangkan produk RCA linear sentiasa disambungkan kepada primer permulaan, penetapan mudah isyarat adalah kelebihan utama.

RCA eksponen, juga dikenali sebagai HRCA penguatan bercabang Hiper (Hyper branched RCA), dalam RCA eksponen, satu primer menguatkan produk RCA, primer kedua berhibrid dengan produk RCA dan memanjang, dan penggantian sudah terikat pada produk RCA Primer hiliran memanjangkan helai, dan mengulangi sambungan dan penggantian untuk menghasilkan produk dendritik RCA.

Kebaikan dan keburukan penguatan asid nukleik bulatan bergulir

Kelebihan RCA:

Kepekaan tinggi, kekhususan yang baik dan operasi yang mudah.

Kekurangan RCA:

Masalah latar belakang semasa pengesanan isyarat.Semasa tindak balas RCA, siasatan padlock tidak beredar dan DNA templat atau RNA probe tidak terikat mungkin menghasilkan beberapa isyarat latar belakang. 

Namplifikasi berasaskan jujukan ucleicacid

Penguatan berasaskan jujukan asid nukleik (NASBA) ialah teknologi baharu yang dibangunkan berdasarkan PCR.Ia adalah penguatan asid nukleik yang berterusan dan isoterma dipandu oleh sepasang primer dengan urutan promoter T7.Teknologi ini boleh menguatkan RNA templat sebanyak kira-kira 109 kali dalam masa kira-kira 2 jam, iaitu 1000 kali lebih tinggi daripada kaedah PCR konvensional dan tidak memerlukan peralatan khas.

Teknologi ini telah digunakan untuk diagnosis cepat penyakit sebaik sahaja ia muncul, dan banyak syarikat kini menggunakan kaedah ini dalam kit pengesanan RNA.

Walaupun penguatan RNA juga boleh menggunakan teknologi PCR transkripsi terbalik, NASBA mempunyai kelebihannya sendiri: ia boleh dijalankan di bawah keadaan suhu yang agak malar, dan ia lebih stabil dan tepat daripada teknologi PCR tradisional.

Tindak balas adalah pada 41 darjah Celsius dan memerlukan transkripase terbalik AMV (virus myeloblastosis burung), RNase H, polimerase RNA T7 dan sepasang primer untuk diselesaikan.

Proses ini terutamanya termasuk:

Primer hadapan mengandungi urutan pelengkap promoter T7.Semasa tindak balas, primer hadapan mengikat pada helai RNA dan dimangkinkan oleh enzim AMV untuk membentuk helai ganda DNA-RNA.

RNase H mencerna RNA dalam untai ganda hibrid dan mengekalkan DNA untai tunggal.

Di bawah tindakan primer terbalik dan enzim AMV, untaian ganda DNA yang mengandungi jujukan promoter T7 terbentuk.

Di bawah tindakan T7 RNA polymerase, proses transkripsi selesai dan sejumlah besar RNA sasaran dihasilkan.

Kelebihan NASBA:

(1) Primernya mempunyai urutan promoter T7, tetapi DNA untai dua asing tidak mempunyai urutan promoter T7 dan tidak boleh dikuatkan, jadi teknologi ini mempunyai kekhususan dan kepekaan yang tinggi.

(2) NASBA secara langsung menggabungkan proses transkripsi terbalik ke dalam tindak balas penguatan, memendekkan masa tindak balas.

Kelemahan NASBA:

(1) Komponen tindak balas adalah lebih rumit.

(2) Tiga jenis enzim diperlukan untuk membuat kos tindak balas lebih tinggi.