Beberapa ciptaan revolusioner dalam sejarah teknologi pengesanan dalam fikiran saya ialah teknologi immunolabeling berdasarkan prinsip pengikatan khusus antigen-antibodi, teknologi PCR dan teknologi penjujukan.Hari ini kita akan bercakap tentang teknologi PCR.Mengikut evolusi teknologi PCR, orang lazimnya membahagikan teknologi PCR kepada tiga generasi: teknologi PCR biasa, teknologi PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata dan teknologi PCR digital.
Cteknik PCR ommon
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis mencipta tindak balas rantai polimerase (tindak balas rantai polimerase, PCR) pada tahun 1983. Dikatakan bahawa ketika dia memandu teman wanitanya, dia tiba-tiba mendapat ilham dan memikirkan prinsip PCR (mengenai faedah memandu).Kary Mullis telah dianugerahkan Hadiah Nobel dalam Kimia pada tahun 1993. The New York Times mengulas: "Sangat asli dan signifikan, hampir membahagikan biologi kepada era pra-PCR dan pasca-PCR.
Prinsip PCR: Di bawah pemangkinan polimerase DNA, DNA untai ibu digunakan sebagai templat, dan primer khusus digunakan sebagai titik permulaan lanjutan, dan DNA untai anak perempuan yang pelengkap kepada DNA templat untai ibu disalin secara in vitro melalui denaturasi, penyepuhlindapan, lanjutan dan langkah-langkah lain.Ia adalah teknologi penguatan sintesis DNA secara in vitro, yang boleh dengan cepat dan khusus menguatkan mana-mana DNA sasaran secara in vitro.
Kelebihan PCR biasa
1.Kaedah klasik, standard antarabangsa dan domestik yang lengkap
2.Kos reagen instrumen yang lebih rendah
3.Produk PCR boleh dipulihkan untuk eksperimen biologi molekul lain
Mesin PCR Foregene yang disyorkan: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Produk berkaitan: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Kelemahan PCR biasa
1.mudah tercemar
2.operasi yang menyusahkan
3.hanya analisis kualitatif
4.Sensitiviti sederhana
5.Terdapat penguatan bukan khusus, dan apabila jalur bukan khusus adalah saiz yang sama dengan jalur sasaran, ia tidak boleh dibezakan
CPCR berasaskan elektroforesis apillary
Sebagai tindak balas kepada kekurangan PCR biasa, beberapa pengeluar telah memperkenalkan instrumen berdasarkan prinsip elektroforesis kapilari.Langkah elektroforesis selepas amplifikasi PCR selesai dalam kapilari.Kepekaan adalah lebih tinggi, dan perbezaan beberapa asas boleh dibezakan dan amplifikasi boleh dikira oleh MAERKER.kandungan produk.Kelemahannya ialah produk PCR masih perlu dibuka dan dimasukkan ke dalam instrumen, dan masih terdapat risiko pencemaran yang besar.
CapillaryElektroforesis
2. Teknologi PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata (Quantitative Real-time PCR, qPCR)PCR kuantitatif pendarfluor, juga dikenali sebagai PCR Masa Nyata, ialah teknologi kuantitatif asid nukleik baharu yang dibangunkan oleh PE (Perkin Elmer) pada tahun 1995. Sejarah pembangunan PCR kuantitatif pendarfluor ialah sejarah perjuangan gergasi yang menggugah jiwa seperti ABI, Roche, dan Bio-Rad.Jika anda berminat, anda boleh menyemaknya.Teknik ini pada masa ini merupakan teknik PCR separa kuantitatif yang paling matang dan digunakan secara meluas.
Mesin qPCR yang disyorkan:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Kaedah pewarna pendarfluor (SYBR Green I):SYBR Green I ialah pewarna pengikat DNA yang paling biasa digunakan untuk PCR kuantitatif, yang mengikat secara tidak khusus kepada DNA beruntai dua.Dalam keadaan bebas, SYBR Green memancarkan pendarfluor yang lemah, tetapi setelah terikat pada DNA beruntai dua, pendarfluornya meningkat 1000 kali ganda.Oleh itu, jumlah isyarat pendarfluor yang dipancarkan oleh tindak balas adalah berkadar dengan jumlah DNA untai dua yang hadir dan akan meningkat dengan pertambahan produk yang dikuatkan.Memandangkan pewarna mengikat secara tidak khusus kepada DNA untai dua, keputusan positif palsu mungkin dihasilkan.
Produk berkaitan: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Kaedah kuar pendarfluor (teknologi Taqman): SemasaPenguatan PCR, probe pendarfluor tertentu ditambah pada masa yang sama dengan sepasang primer.Siasatan ialah oligonukleotida linear, dengan kumpulan wartawan pendarfluor dan kumpulan pelindapkejut pendarfluor masing-masing dilabelkan pada kedua-dua hujungnya.Apabila probe utuh, isyarat pendarfluor yang dipancarkan oleh kumpulan wartawan diserap oleh kumpulan pelindapkejut, dan pengesanan Tiada isyarat pendarfluor;semasa penguatan PCR (dalam peringkat lanjutan), aktiviti Dicer 5'-3' enzim Taq akan mencerna dan merendahkan probe, supaya kumpulan pendarfluor reporter dan kumpulan pendarfluor pelindapkejut dipisahkan, supaya sistem pemantauan pendarfluor Isyarat pendarfluor boleh diterima, iaitu, setiap kali rantaian DNA dikuatkan, penyegerakan molekul pendarfluor yang lengkap membentuk molekul pendarfluor yang disegerakkan. pembentukan produk PCR.Kaedah siasatan Taqman adalah kaedah pengesanan yang paling biasa digunakan dalam pengesanan klinikal.
Produk berkaitan: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Kelebihan qPCR
1.Kaedah ini matang dan peralatan sokongan dan reagen adalah lengkap
2.Kos sederhana reagen
3.mudah untuk digunakan
4.Kepekaan dan kekhususan pengesanan tinggi
Kelemahan qPCR
Mutasi gen sasaran membawa kepada pengesanan yang tidak dijawab.
Hasil pengesanan templat kepekatan rendah tidak dapat ditentukan.
Terdapat ralat besar apabila menggunakan lengkung standard untuk pengesanan kuantitatif.
3. Teknologi PCR digital (digital PCR, dPCR).
PCR digital ialah teknik untuk pengiraan mutlak molekul asid nukleik.Berbanding dengan qPCR, PCR digital boleh membaca terus bilangan molekul DNA/RNA, yang merupakan kuantifikasi mutlak molekul asid nukleik dalam sampel permulaan.Pada tahun 1999, Bert Vogelstein dan Kenneth W. Kin-zler secara rasmi mencadangkan konsep dPCR.
Pada tahun 2006, Fluidigm adalah yang pertama menghasilkan instrumen dPCR berasaskan cip komersial.Pada tahun 2009, Life Technologies melancarkan sistem dPCR OpenArray dan QuantStudio 12K Flex.Pada 2013, Life Technologies melancarkan sistem QuantStudio 3DdPCR, yang menggunakan teknologi cip mikrofluidik skala nano berketumpatan tinggi untuk mengedarkan sampel secara sama rata kepada 20,000 sel individu.dalam tindak balas dengan baik.
Pada tahun 2011, Bio-Rad melancarkan instrumen dPCR QX100 berasaskan titisan, yang menggunakan teknologi air dalam minyak untuk mengagihkan sampel secara sama rata kepada 20,000 titisan-air-dalam-minyak, dan menggunakan penganalisis titisan untuk menganalisis titisan.Pada tahun 2012, RainDance melancarkan instrumen dPCR RainDrop, didorong oleh gas tekanan tinggi, untuk membahagikan setiap sistem tindak balas standard kepada emulsi tindak balas yang mengandungi 1 juta hingga 10 juta titisan mikro peringkat picoliter.
Setakat ini, PCR digital telah membentuk dua puak utama, jenis cip dan jenis titisan.Tidak kira apa jenis PCR digital, prinsip terasnya mengehadkan pencairan, PCR titik akhir dan pengedaran Poisson.Sistem tindak balas PCR standard yang mengandungi templat asid nukleik dibahagikan sama rata kepada puluhan ribu tindak balas PCR, yang diedarkan kepada cip atau titisan mikro, supaya setiap tindak balas mengandungi sebanyak mungkin molekul templat, dan tindak balas PCR templat molekul tunggal dilakukan.Dengan membaca pendarfluor Kehadiran atau ketiadaan isyarat dikira, dan kuantifikasi mutlak dilakukan selepas penentukuran taburan Poisson statistik.
Berikut adalah ciri beberapa platform PCR digital yang saya gunakan:
1. Bio-Rad QX200 titisan digital PCR Bio-RadQX200 ialah platform PCR digital yang sangat klasik, proses pengesanan asas: 20,000 sampel dihasilkan oleh penjana titisan Titisan mikro air dalam minyak dikuatkan pada mesin PCR biasa, dan akhirnya isyarat pendarfluor setiap titisan mikro dibaca oleh pembaca titisan mikro.Operasinya lebih rumit, dan risiko pencemaran adalah sederhana.
PCR digital titisan mikro Xinyi TD1Xinyi TD1 ialah platform PCR digital domestik, proses pengesanan asas: menjana 30,000-50,000 titisan air dalam minyak melalui penjana titisan, menguatkan pada instrumen PCR biasa, dan akhirnya lulus Pembaca titisan membaca isyarat pendarfluor setiap titisan.Penjanaan titisan dan pembacaan dalam platform ini dilakukan dalam cip khusus dengan risiko pencemaran yang rendah.
PCR digital cip titisan mikro STILLA NaicaSTILLA Naica ialah platform PCR digital yang agak baharu.Proses pengesanan asas ialah: menambah penyelesaian tindak balas pada cip, meletakkan cip ke dalam penjanaan titisan mikro dan sistem penguatan, dan menjana 30,000 titisan mikro.Sebarkan pada cip, dan penguatan PCR selesai pada cip.Kemudian cip yang dikuatkan dipindahkan ke sistem analisis bacaan titisan mikro, dan isyarat pendarfluor dibaca dengan mengambil gambar.Oleh kerana keseluruhan proses berlaku dalam cip tertutup, risiko pencemaran adalah rendah.
4. ThermoFisher QuantStudio cip 3D PCR digital
ThermoFisher QuantStudio 3D ialah satu lagi platform PCR digital berasaskan cip klasik.Proses pengesanan asasnya ialah: tambahkan larutan tindak balas ke dalam penyebar, dan sebarkan penyelesaian tindak balas secara sama rata pada cip dengan 20,000 microwell melalui penyebar., letakkan cip pada mesin PCR untuk menguatkan, dan akhirnya masukkan cip ke dalam pembaca dan ambil gambar untuk membaca isyarat pendarfluor.Operasi ini agak rumit, dan keseluruhan proses dijalankan dalam cip tertutup, dan risiko pencemaran adalah rendah.
5. PCR digital cip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity ialah platform PCR digital jenis cip yang agak baharu.Proses pengesanan asasnya ialah: tambahkan larutan tindak balas ke dalam aplikator, dan sebarkan larutan tindak balas secara sama rata pada 10,000 tiub PCR yang dipasang dalam tiub PCR melalui aplikator.Pada cip mikroporous, larutan tindak balas memasuki cip melalui tindakan kapilari, dan tiub PCR dengan cip diletakkan pada mesin PCR untuk penguatan, dan akhirnya cip dimasukkan ke dalam pembaca untuk membaca isyarat pendarfluor dengan mengambil gambar.Operasinya lebih rumit.Risiko pencemaran adalah rendah.
Parameter setiap platform PCR digital diringkaskan seperti berikut:
Penunjuk penilaian platform PCR digital ialah: bilangan unit split, bilangan saluran pendarfluor, kerumitan operasi dan risiko pencemaran.Tetapi perkara yang paling penting ialah ketepatan pengesanan.Satu cara untuk menilai platform PCR digital ialah menggunakan berbilang platform PCR digital untuk mengesahkan satu sama lain, dan cara lain ialah menggunakan bahan standard dengan nilai yang tepat.
Kelebihan dPCR
1.Mencapai kuantifikasi mutlak
2.Kepekaan dan kekhususan yang lebih tinggi
3.Boleh mengesan sampel salinan rendah
Kelemahan dPCR1. Peralatan dan reagen yang mahal 2. Operasi yang rumit dan masa pengesanan yang lama 3. Julat pengesanan yang sempit
Pada masa ini, tiga generasi teknologi PCR mempunyai kelebihan dan kekurangan masing-masing, dan masing-masing mempunyai bidang aplikasi sendiri, dan bukan hubungan yang menggantikan satu generasi yang lain.Kemajuan teknologi yang berterusan telah menyuntik tenaga baharu ke dalam teknologi PCR, membolehkannya membuka kunci satu demi satu arah aplikasi, menjadikan pengesanan asid nukleik lebih mudah dan tepat.
Sumber: Dr. Yuan membawa anda untuk ujian
Produk yang disyorkan:
Masa siaran: Nov-18-2022
