Sebagai yang baru di makmal, ia bukanlah satu kerja yang baik untuk menyaring tumbuhan positif daripada sekumpulan tumbuhan dengan kadar penukaran yang rendah.Pertama, DNA mesti diekstrak daripada sejumlah besar sampel satu demi satu, dan kemudian gen asing akan dikesan oleh PCR.Walau bagaimanapun, keputusan selalunya kosong dan jalur dengan beberapa item sekali-sekala, tetapi adalah mustahil untuk menentukan sama ada terdapat pengesanan terlepas atau pengesanan palsu..Adakah sangat tidak berdaya untuk menghadapi proses dan keputusan eksperimen sedemikian?Jangan risau, abang ajar cara saring tumbuhan positif transgenik dengan mudah dan tepat.

Langkah 1

Primer pengesanan reka bentuk

Tentukan gen endogen dan gen eksogen untuk dikesan mengikut sampel yang akan diuji, dan pilih jujukan wakil 100-500bp dalam gen untuk reka bentuk primer.Primer yang baik boleh memastikan ketepatan hasil pengesanan dan memendekkan masa pengesanan (lihat lampiran untuk primer pengesanan yang biasa digunakan).

Notis: Primer yang baru direka bentuk perlu mengoptimumkan keadaan tindak balas dan mengesahkan ketepatan, ketepatan dan had pengesanan pengesanan sebelum pengesanan berskala besar.

Langkah 2

Reka bentuk protokol eksperimen

Kawalan positif: Gunakan DNA tulen yang mengandungi serpihan sasaran sebagai templat untuk menentukan sama ada sistem dan keadaan tindak balas PCR adalah normal.

Kawalan negatif/kosong: Gunakan templat DNA atau ddH2O yang tidak mengandungi serpihan sasaran sebagai templat untuk mengesan sama ada terdapat sumber pencemaran dalam sistem PCR.

Kawalan rujukan dalaman: gunakan gabungan primer/probe gen endogen sampel untuk diuji untuk menilai sama ada templat boleh dikesan oleh PCR.

Notis:

Kawalan positif, negatif/kosong dan kawalan kawalan dalaman hendaklah ditetapkan untuk setiap ujian untuk menilai kesahihan keputusan eksperimen.

Penyediaan eksperimen

Sebelum digunakan, perhatikan sama ada larutan bercampur rata.Sekiranya pemendakan dijumpai, ia perlu dibubarkan dan dicampur mengikut arahan sebelum digunakan.Campuran 2×PCR perlu dipipet dan dicampur berulang kali dengan mikropipet sebelum digunakan untuk mengelakkan pengagihan ion tidak sekata.

Notis:

Keluarkan manual dan baca dengan teliti, dan buat persediaan sebelum eksperimen mengikut ketat dengan keperluan manual.

Langkah 4

Sediakan sistem tindak balas PCR

Menurut protokol eksperimen, campurkan primer, H2O, dan 2×PCR gaul rata, sentrifuge dan edarkannya ke setiap tiub tindak balas.

Notis:

Untuk ujian berskala besar atau jangka panjang, disyorkan untuk menggunakan sistem tindak balas PCR yang mengandungi enzim UNG, yang boleh mengelakkan pencemaran aerosol yang disebabkan oleh produk PCR dengan berkesan.

Langkah 5

Tambah templat tindak balas

Menggunakan teknologi PCR Langsung, tidak ada keperluan untuk proses penulenan asid nukleik yang membosankan, templat sampel boleh disediakan dalam masa 10 minit, dan sistem tindak balas PCR yang sepadan boleh ditambah.

Notis:

Kaedah belahan mempunyai kesan pengesanan yang lebih baik, dan produk yang diperoleh boleh digunakan untuk tindak balas pengesanan berbilang.

5.1: Pengembangan langsung daun

Mengikut saiz gambar dalam manual, potong tisu daun dengan diameter 2-3mm dan letakkan dalam sistem tindak balas PCR.

Nota: Pastikan serpihan daun direndam sepenuhnya dalam larutan tindak balas PCR, dan jangan tambah tisu daun yang berlebihan.

5.2: Kaedah belah daun

Potong tisu daun dengan diameter 5-7mm dan letakkan dalam tiub emparan.Jika anda memilih daun yang matang, sila elakkan menggunakan tisu urat utama daun.Pipet 50ul Buffer P1 lysate ke dalam tiub centrifuge untuk memastikan bahawa lysate dapat merendam sepenuhnya tisu daun, letakkannya dalam kitar haba atau mandi logam, dan lisis pada 95°C selama 5-10 minit.

Tambah larutan peneutralan Penampan P2 50ul dan gaul rata.Lisat yang terhasil boleh digunakan sebagai templat dan ditambah kepada sistem tindak balas PCR.

Nota: Jumlah templat adalah antara 5-10% daripada sistem PCR, dan tidak boleh melebihi 20% (contohnya, dalam sistem PCR 20μl, tambah 1-2μl larutan lisis, tidak lebih daripada 4μl).

Langkah 6

tindak balas PCR

Selepas mengempar tiub tindak balas PCR, ia diletakkan dalam instrumen PCR untuk penguatan.

Notis:

Tindak balas menggunakan templat bukan tulen untuk penguatan, jadi bilangan kitaran penguatan adalah 5-10 lebih kitaran berbanding apabila menggunakan templat DNA tulen.

Langkah 7

Pengesanan elektroforesis dan analisis keputusan

M: Tangga DNA 100bp

1\4: Kaedah DNA yang disucikan

2\5: Kaedah PCR terus

3\6: Kawalan kosong

QC:

Keputusan ujian pelbagai kawalan yang ditetapkan dalam eksperimen harus memenuhi syarat berikut.Jika tidak, punca masalah perlu dianalisis, dan ujian perlu dilakukan semula selepas masalah itu dihapuskan.

Jadual 1. Keputusan ujian normal pelbagai kumpulan kawalan

*Apabila plasmid digunakan sebagai kawalan positif, keputusan ujian gen endogen boleh menjadi negatif

Keputusan penghakiman:

A. Keputusan ujian gen endogen sampel adalah negatif, menunjukkan bahawa DNA yang sesuai untuk pengesanan PCR biasa tidak boleh diekstrak daripada sampel atau DNA yang diekstrak mengandungi perencat tindak balas PCR, dan DNA perlu diekstrak semula.

B. Keputusan ujian gen endogen sampel adalah positif, dan keputusan ujian gen eksogen adalah negatif, menunjukkan bahawa DNA yang sesuai untuk pengesanan PCR biasa diekstrak daripada sampel, dan boleh dinilai bahawa gen XXX tidak dikesan dalam sampel.

C. Keputusan ujian gen endogen sampel adalah positif, dan keputusan ujian gen eksogen adalah positif, menunjukkan bahawa DNA yang sesuai untuk pengesanan PCR biasa telah diekstrak daripada sampel, dan sampel DNA mengandungi gen XXX.Eksperimen pengesahan boleh dijalankan selanjutnya.

Langkah 8

Primer pengesanan reka bentuk

Selepas eksperimen, gunakan larutan natrium hipoklorit 2% dan larutan etanol 70% untuk mengelap kawasan eksperimen untuk mengelakkan pencemaran alam sekitar。