Transkripase songsang tradisional tidak boleh bertolak ansur dengan suhu tinggi (suhu optimum untuk aktiviti MMLV ialah 37-50°C, dan AMV ialah 42-60°C).RNA virus yang lebih kompleks tidak boleh ditranskripsikan secara berkesan ke dalam cDNA pada suhu rendah, mengakibatkan kecekapan pengesanan Pengurangan.RT-qPCR tradisional secara amnya memerlukan penyertaan dua enzim utama (transkripase terbalik dan polimerase DNA), yang menjadikannya mustahil untuk memudahkan operasi sistem tindak balas dan mengurangkan kos.Di sini kami akan memperkenalkan dua transkripase songsang tahan suhu tinggi, TtH dan RevTaq.Kedua-dua enzim ini juga mempunyai fungsi DNA polimerase, oleh itu ia dipanggil enzim bifungsi.

TtH DNA polimerase

Anda pasti pernah mendengar tentang TtH, yang berasal daripada bakteria thermophilic Thermus thermophilus HB8.Dengan kehadiran kation divalen seperti Mg2+, ia mempunyai aktiviti polimerase DNA.Ia digunakan secara meluas dalam tindak balas PCR seperti enzim Taq, tetapi ia mempunyai rintangan haba yang lebih tinggi daripada enzim Taq, jadi ia juga mempunyai kesan yang lebih baik pada PCR dengan templat kandungan GC yang tinggi.

· Enzim ini pada asasnya tidak mempunyai aktiviti eksonuklease 3′→5′ dan aktiviti eksonuklease 5′→3′, jadi ia juga boleh digunakan untuk penjujukan dideoksi.

· Enzim ini mempunyai aktiviti RTase.Dengan kehadiran Mn2+, aktiviti RTase akan dipertingkatkan.Menggunakan ciri ini, ia boleh digunakan untuk melakukan tindak balas transkripsi terbalik dan tindak balas PCR dalam tiub yang sama, iaitu RT-PCR satu langkah.Walau bagaimanapun, dengan kehadiran Mn2+, ketepatan RT-PCR tidak tinggi.Aktiviti RT tiada kaitan dengan aktiviti rnaase H.

· Peningkatan aktiviti polimerase Tth-DNA (pH9, optimum +55℃～+70℃, maksimum +95℃) mengatasi masalah yang disebabkan oleh struktur sekunder RNA.cDNA yang terhasil boleh dikuatkan oleh PCR dengan enzim yang sama dengan kehadiran ion Mg2+.

· Keupayaan polimerase Tth-DNA untuk melakukan transkripsi terbalik dan amplifikasi DNA pada suhu tinggi menjadikan enzim ini berguna untuk analisis kuantitatif RT-PCR, pengklonan, dan ekspresi gen RNA selular dan virus.
· Polimerase Tth-DNA digunakan untuk RT-PCR untuk menguatkan RNA sehingga 1kb.

Ciri dan kelebihan

Polimerase DNA Tth:

• Pastikan saiz produk tindak balas rantai polimerase (PCR) yang dioptimumkan, sekurang-kurangnya 1000 bp dalam tindak balas RT-PCR

• Terima deoksiribonukleosida trifosfat yang diubah suai sebagai substrat

• Tidak berkaitan dengan aktiviti RNase H

• Mempunyai kestabilan haba yang tinggi untuk mengatasi masalah, biasanya berkaitan dengan struktur sekunder tinggi yang terdapat dalam RNA

RevTaq RT-PCR DNA polimerase

Polimerase DNA tahan haba dengan aktiviti transkripase terbalik

RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase ialah enzim yang direka bentuk, sangat tahan haba, dwi-fungsi dengan transkripase terbalik dan aktiviti polimerase DNA yang diperoleh melalui evolusi terarah dan buatan.

· Separuh hayat RevTaq RT-PCR DNA polimerase pada 95°C adalah lebih daripada 40 minit.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase membenarkan transkripsi songsang suhu tinggi terus daripada templat RNA, dan langkah transkripsi terbalik boleh diulang beberapa kali untuk menjana lebih banyak templat cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase membenarkan RT-PCR "langkah sifar" (tiada langkah transkripsi terbalik isoterma), kerana dalam langkah lanjutan PCR kitaran, transkripsi terbalik dan penguatan DNA berlaku serentak.Ini juga menggalakkan tindak balas transkripsi terbalik pada suhu tinggi, dengan itu meminimumkan masalah yang dihadapi dalam mencairkan struktur sekunder yang kuat dalam RNA pada suhu tinggi.

· Disebabkan oleh formula hot-start berasaskan aptamer, RevTaq RT-PCR DNA polymerase akan menghasilkan hasil yang lebih baik apabila suhu penyepuhlindapan dan sambungan lebih tinggi daripada 57°C.

· Memandangkan enzim tahan haba, disyorkan untuk mereka bentuk primer dan probe dengan takat lebur yang sangat tinggi (>60°C).

· Adalah disyorkan untuk mengoptimumkan suhu langkah penyepuhlindapan/pelanjutan melalui kecerunan suhu semasa proses persediaan tindak balas.

· Semakin tinggi suhu, semakin tinggi kekhususan PCR.Kitaran transkripsi terbalik biasanya dilakukan pada suhu yang lebih tinggi daripada kitaran PCR, kerana penghibridan Templat Primer DNA:RNA biasanya mempunyai takat lebur yang lebih tinggi daripada dupleks Templat Primer DNA:cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerase direka bentuk secara genetik dan dioptimumkan, dan saiz amplikon adalah antara 60-300 bp.

Had pengesanan polimerase DNA RevTaq RT-PCR mencecah 4 salinan/

Sistem tindak balas yang dioptimumkan (penubuhan primer takat lebur tinggi) ditunjukkan dalam rajah.RT-PCR dipacu DNA polimerase RevTaq RT-PCR menunjukkan kepekaan yang lebih baik daripada campuran induk RT-qPCR 1 langkah TaqPath, dan pengesanan yang lebih rendah Kecerunan pencairan sampel.

Lebih banyak kelebihan:

Fungsi mula cepat → Langkah denaturasi terma awal boleh dilangkau.

Formula aptamer permulaan panas → Sediakan aktiviti enzim 100% dengan segera dan cegah penguatan tidak spesifik pada suhu rendah (<57°C).

Fungsi belahan → Langkah pengekstrakan RNA diabaikan, kerana polimerase DNA RevTaq RT-PCR juga boleh memproses sampel tindak balas kasar.Ia boleh segera memusnahkan membran sel eukariota, bakteria dan virus dalam kitaran RT-PCR yang panas.

Tahap bahan mentah IVD → standard kualiti tinggi dan harga yang sangat kompetitif