Bahan permulaan: RNA
PCR transkripsi terbalik kuantitatif (RT-qPCR) ialah kaedah eksperimen yang digunakan dalam eksperimen PCR menggunakan RNA sebagai bahan permulaan.Dalam kaedah ini, jumlah RNA atau messenger RNA (mRNA) mula-mula ditranskripsikan ke dalam DNA pelengkap (cDNA) oleh transkripase terbalik.Selepas itu, tindak balas qPCR dilakukan menggunakan cDNA sebagai templat.RT-qPCR telah digunakan dalam pelbagai aplikasi biologi molekul, termasuk analisis ekspresi gen, pengesahan gangguan RNA, pengesahan mikroarray, pengesanan patogen, ujian genetik dan penyelidikan penyakit.
Kaedah satu langkah dan dua langkah untuk RT-qPCR
RT-qPCR boleh dicapai dengan kaedah satu langkah atau dua langkah.RT-qPCR satu langkah menggabungkan transkripsi terbalik dan amplifikasi PCR, membolehkan transkripase terbalik dan polimerase DNA melengkapkan tindak balas dalam tiub yang sama di bawah keadaan penimbal yang sama.RT-qPCR satu langkah hanya memerlukan penggunaan primer khusus jujukan.Dalam RT-qPCR dua langkah, transkripsi terbalik dan amplifikasi PCR dilakukan dalam dua tiub, menggunakan penimbal optimum yang berbeza, keadaan tindak balas dan strategi reka bentuk primer.
| Kelebihan | Keburukan | |
| Satu langkah | Kaedah ini mempunyai kurang ralat eksperimen kerana kedua-dua tindak balas dilakukan dalam satu tiub
Kurang langkah paip mengurangkan risiko pencemaran
Sesuai untuk amplifikasi/penyaringan throughput tinggi, pantas dan boleh dihasilkan semula | Tindak balas dua langkah tidak boleh dioptimumkan secara berasingan
Memandangkan keadaan tindak balas dikompromi dengan menggabungkan tindak balas dua langkah, sensitiviti tidak sebaik kaedah dua langkah
Bilangan sasaran yang dikesan oleh satu sampel adalah kecil |
| Dua Langkah | Keupayaan untuk mencipta perpustakaan cDNA yang stabil yang boleh disimpan untuk jangka masa yang lama dan digunakan dalam pelbagai tindak balas
Gen sasaran dan gen rujukan boleh dikuatkan daripada perpustakaan cDNA yang sama tanpa memerlukan beberapa perpustakaan cDNA
Penampan tindak balas dan keadaan tindak balas yang membolehkan pengoptimuman larian tindak balas tunggal
Pemilihan syarat pencetus yang fleksibel | Menggunakan berbilang tiub, dan lebih banyak langkah paip meningkatkan risiko pencemaran DNA, dan memakan masa.
Memerlukan lebih pengoptimuman daripada kaedah satu langkah |
Produk Berkaitan:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Satu Langkah)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Satu Langkah)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Untuk Sintesis CDNA First-Strand
PCR Masa Nyata Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Pemilihan jumlah RNA dan mRNA
Apabila mereka bentuk eksperimen RT-qPCR, adalah penting untuk memutuskan sama ada untuk menggunakan jumlah RNA atau mRNA yang telah dimurnikan sebagai templat untuk transkripsi terbalik.Walaupun mRNA mungkin dapat memberikan sensitiviti yang lebih tinggi sedikit, jumlah RNA masih kerap digunakan.Sebabnya ialah jumlah RNA mempunyai kelebihan yang lebih penting sebagai bahan permulaan daripada mRNA.Pertama, proses itu memerlukan lebih sedikit langkah penulenan, yang memastikan pemulihan kuantitatif templat yang lebih baik dan penormalan hasil yang lebih baik kepada nombor sel permulaan.Kedua, ia mengelakkan langkah pengayaan mRNA, yang boleh mengelakkan kemungkinan keputusan yang condong disebabkan oleh pemulihan yang berbeza bagi mRNA yang berbeza.Secara keseluruhannya, memandangkan dalam kebanyakan aplikasi, kuantifikasi relatif gen sasaran adalah lebih penting daripada sensitiviti mutlak pengesanan, jumlah RNA lebih sesuai dalam kebanyakan kes.
Primer transkripsi terbalik
Dalam kaedah dua langkah, tiga kaedah berbeza boleh digunakan untuk memulakan tindak balas cDNA: primer oligo(dT), primer rawak atau primer khusus jujukan.Biasanya, primer oligo(dT) dan primer rawak digunakan dalam kombinasi.Primer ini melekat pada untaian mRNA templat dan menyediakan transkripase terbalik dengan titik permulaan untuk sintesis.
| Pemilihan primer | Struktur dan fungsi | Kelebihan | Keburukan |
| Primer oligo(dT) (atau primer oligo(dT) berlabuh) | Penyepuhlindapan lanjutan kepada sisa timin pada ekor poli(A) mRNA;primer anchor oligo(dT) mengandungi G, C, atau A pada hujung 3′ (tapak sauh) | Sintesis cDNA panjang penuh daripada mRNA ekor poli(A).
Berkenaan apabila kurang bahan permulaan tersedia
Tapak penambat memastikan bahawa primer oligo(dT) mengikat pada ekor 5′ poli(A) mRNA | Hanya sesuai untuk menguatkan gen dengan ekor poli(A).
Dapatkan cDNA yang dipotong dari tapak penyebuan*2 dalam poli(A)
Berat sebelah untuk mengikat ke hujung 3′*
*Kemungkinan ini diminimumkan jika primer oligo(dT) berlabuh digunakan |
| primer rawak
| 6 hingga 9 tapak panjang, yang boleh menyelinap ke beberapa tapak semasa transkripsi RNA | Anil kepada semua RNA (tRNA, rRNA, dan mRNA)
Sesuai untuk transkrip dengan struktur sekunder yang ketara, atau apabila kurang bahan permulaan tersedia
Hasil cDNA yang tinggi | cDNA ditranskripsi terbalik daripada semua RNA, yang biasanya tidak diingini dan boleh mencairkan isyarat mRNA sasaran
dapatkan cDNA terpotong |
| primer khusus urutan | Primer tersuai yang menyasarkan jujukan mRNA tertentu | perpustakaan cDNA tertentu
Meningkatkan sensitiviti
Menggunakan primer qPCR terbalik | Hanya terhad kepada sintesis gen sasaran tunggal |
Transkripase terbalik
Transkripase terbalik ialah enzim yang menggunakan RNA untuk mensintesis DNA.Sesetengah transkripase terbalik mempunyai aktiviti RNase dan boleh merendahkan helai RNA dalam helai hibrid RNA-DNA selepas transkripsi.Jika ia tidak mempunyai aktiviti enzimatik RNase, RNaseH boleh ditambah untuk kecekapan qPCR yang lebih tinggi.Enzim yang biasa digunakan termasuk Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase dan avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Untuk RT-qPCR, adalah sesuai untuk memilih transkripase terbalik dengan kestabilan termostabil yang lebih tinggi, supaya sintesis cDNA boleh dilakukan pada suhu yang lebih tinggi, memastikan transkripsi RNA yang berjaya dengan struktur sekunder yang lebih tinggi, sambil mengekalkan aktiviti penuhnya sepanjang tindak balas, menghasilkan hasil cDNA yang lebih tinggi.
Produk Berkaitan:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Aktiviti RNase H transkripase terbalik
RNaseH mampu merendahkan helai RNA daripada dupleks RNA-DNA, membolehkan sintesis DNA untai dua yang cekap.Walau bagaimanapun, apabila menggunakan mRNA panjang sebagai templat, RNA mungkin terdegradasi lebih awal, mengakibatkan cDNA terpotong.Oleh itu, selalunya berfaedah untuk meminimumkan aktiviti RNaseH semasa pengklonan cDNA jika sintesis transkrip panjang dikehendaki.Sebaliknya, transkripase terbalik dengan aktiviti RNase H selalunya bermanfaat untuk aplikasi qPCR kerana ia meningkatkan pencairan dupleks RNA-DNA semasa kitaran pertama PCR.
Reka bentuk primer
Primer PCR yang digunakan untuk langkah qPCR dalam RT-qPCR sepatutnya direka bentuk untuk merentangi persimpangan ekson-ekson, di mana primer penguatan berpotensi merentangi sempadan ekson-intron sebenar.Memandangkan jujukan DNA genom yang mengandungi intron tidak dikuatkan, reka bentuk ini mengurangkan risiko positif palsu yang dikuatkan daripada mencemari DNA genomik.
Jika primer tidak boleh direka bentuk untuk memisahkan sempadan ekson atau ekson-ekson, mungkin perlu merawat sampel RNA dengan DNase I atau dsDNase bebas RNase untuk membuang pencemaran DNA genomik.
Kawalan RT-qPCR
Kawalan negatif transkripsi songsang (kawalan-RT) harus disertakan dalam semua eksperimen RT-qPCR untuk mengesan pencemaran DNA (seperti DNA genomik atau produk PCR daripada tindak balas sebelumnya).Kawalan ini mengandungi semua komponen tindak balas kecuali transkripase terbalik.Oleh kerana transkripsi terbalik tidak berlaku dengan kawalan ini, jika amplifikasi PCR diperhatikan, kemungkinan besar pencemaran daripada DNA.
Masa siaran: Ogos-02-2022
