Pada peringkat awal wabak, disebabkan perkembangan pesat, diagnosis pantas pesakit yang disyaki adalah kunci untuk mencegah COVID-19.Sesetengah reagen pengesanan asid nukleik yang diluluskan mempunyai masa pembangunan yang singkat, dan terdapat masalah seperti pengesahan prestasi tergesa-gesa, pengoptimuman reagen yang tidak mencukupi, dan perbezaan besar antara kelompok;Masalah pelbagai makmal klinikal dalam pelbagai aspek proses pengesanan asid nukleik juga boleh menjejaskan ketepatan keputusan pengesanan asid nukleik.Artikel ini akan menumpukan pada pautan dan perkara utama dalam pengesanan asid nukleik SARS-CoV-2 semasa, dan menganalisis masalah pemeriksaan semula negatif dan positif palsu pengesanan asid nukleik makmal dan ketidakkonsistenan klinikal.

Prinsip pengesanan asid nukleik SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 ialah virus RNA dengan jujukan genom kira-kira 29 kb, dengan 10 gen, yang boleh mengekod 10 protein dengan berkesan.Virus terdiri daripada RNA dan protein, dan lapisan paling luar adalah salutan luar yang terdiri daripada lipid dan glikoprotein.Di dalam, kapsid protein membalut RNA di dalamnya, dengan itu melindungi RNA yang mudah terdegradasi (P1).

Struktur P1 SARS-COV-2

Virus menyerang sel melalui reseptor permukaan sel tertentu untuk menyebabkan jangkitan, dan menggunakan sel perumah untuk mereplikasi.

Prinsip pengesanan asid nukleik virus adalah untuk mendedahkan RNA virus melalui lisat sel, dan kemudian menggunakan tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik pendarfluor masa nyata (RT-PCR) untuk pengesanan.

Kunci kepada prinsip pengesanan ialah menggunakan primer dan probe untuk mencapai "padanan yang disasarkan" bagi jujukan asid nukleik, iaitu, untuk mencari jujukan asid nukleik SARS-CoV-2 yang berbeza daripada virus lain dalam kira-kira 30,000 bes (persamaan asid nukleik dengan virus lain) kawasan "Rendah"), reka bentuk primer dan probe.

Primer dan probe sangat dipadankan dengan kawasan khusus asid nukleik SARS-CoV-2, iaitu, kekhususannya sangat kuat.Setelah hasil amplifikasi RT-PCR pendarfluor masa nyata bagi sampel yang akan diuji adalah positif, ia membuktikan bahawa SARS-CoV-2 hadir dalam sampel.Lihat P2.

Langkah P2 penentuan asid nukleik SARS-CoV-2 (RT-PCR pendarfluor masa nyata)

Keadaan dan keperluan makmal untuk pengesanan asid nukleik SARS-CoV-2

Makmal ujian asid nukleik adalah yang paling sesuai untuk persekitaran tekanan negatif, dan mereka harus memberi perhatian kepada pemantauan tekanan, memastikan udara mengalir, dan menghapuskan aerosol.Kakitangan ujian asid nukleik mesti mempunyai kelayakan yang sepadan, menerima latihan tindak balas rantai polimerase yang berkaitan dan lulus penilaian.Makmal hendaklah diuruskan dengan ketat, dizonkan di tempatnya, dan kakitangan yang tidak berkaitan dilarang sama sekali masuk.Kawasan yang bersih hendaklah berventilasi dan dibasmi kuman di tempatnya.Item yang berkaitan diletakkan di zon, bersih dan kotor diasingkan, diganti tepat pada masanya dan dinyahkontaminasi di tempatnya.Pembasmian kuman rutin: Pembasmian kuman yang mengandungi klorin adalah penyelesaian utama untuk kawasan yang lebih besar, dan 75% alkohol boleh digunakan untuk kawasan kecil.Cara yang baik untuk menangani aerosol adalah dengan membuka tingkap untuk pengudaraan, dan pembasmian kuman udara juga boleh dilakukan melalui sinar ultraungu, penapisan dan pembasmian kuman udara.

Pautan utama dan parameter penentuan asid nukleik SARS-CoV-2 (RT-PCR pendarfluor masa nyata)

Walaupun makmal secara amnya memberi perhatian yang teliti kepada "pengesanan" asid nukleik, sebenarnya, "pengekstrakan" asid nukleik juga merupakan salah satu langkah utama untuk pengesanan yang berjaya, yang berkait rapat dengan pengumpulan dan penyimpanan sampel virus.

Pada masa ini, sampel pernafasan yang paling banyak digunakan, seperti swab nasofaring, menggunakan kaedah kedua, iaitu larutan penyahaktifan (pemeliharaan) yang disediakan berdasarkan pengekstrakan asid nukleik dan larutan lisis.Di satu pihak, penyelesaian pemeliharaan virus ini boleh menyahtukarkan protein virus, kehilangan aktivitinya dan tidak lagi berjangkit, dan meningkatkan keselamatan peringkat pengangkutan dan pengesanan;sebaliknya, ia boleh memecahkan virus secara langsung untuk melepaskan asid nukleik, menghapuskan enzim pengurai asid nukleik, dan mencegah virus.RNA terdegradasi.

Penyelesaian pensampelan virus yang disediakan berdasarkan larutan lisis pengekstrakan asid nukleik.Komponen utama ialah garam seimbang, agen pengkelat asid etilenadiaminetetraacetic, garam guanidine (guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, dsb.), surfaktan anionik (dodecane) Sodium sulfate), surfaktan kationik (tetradecyl trimethyl ammonium oxalate), fenol, 8-thixyoquinoline lebih banyak komponen dan.Pada masa ini, terdapat banyak jenis kit pengekstrakan asid nukleik, dan pengekstrakan asid nukleik yang berbeza dan reagen penulenan digunakan.Walaupun pengekstrakan asid nukleik dan reagen penulenan yang sama digunakan, prosedur pengekstrakan setiap kit adalah berbeza.

Pada masa ini, produk kit pengesanan asid nukleik yang diluluskan oleh Pentadbiran Produk Perubatan Kebangsaan dipilih berdasarkan gen ORF1ab, E dan N dalam genom SARS-CoV-2.Prinsip pengesanan produk yang berbeza pada asasnya adalah sama, tetapi primer dan reka bentuk probe mereka berbeza.Terdapat segmen sasaran tunggal (ORF1ab), segmen dwi sasaran (ORF1ab, N atau E), dan segmen tiga sasaran (ORF1ab, N dan E).Perbezaan antara pengesanan dan tafsiran, pengekstrakan asid nukleik dan sistem tindak balas RT-PCR pendarfluor masa nyata harus merujuk kepada arahan kit yang berkaitan, dan adalah disyorkan agar pengguna mematuhi kaedah tafsiran yang dinyatakan dalam arahan kit untuk tafsiran.Kawasan biasa, primer dan jujukan probe yang dikuatkan oleh RT-PCR pendarfluor masa nyata ditunjukkan dalam P3.

P3 Lokasi sasaran amplikon SARS-CoV-2 pada genom dan jujukan primer dan probe

Tafsiran keputusan penentuan asid nukleik SARS-CoV-2 (Real-Time pendarfluor RT-PCR)

“Pelan Pencegahan dan Kawalan Pneumonia untuk Jangkitan SARS-CoV-2 (Edisi Kedua)” buat kali pertama menjelaskan kriteria untuk menilai keputusan penguatan gen tunggal:

1. Tiada Ct atau Ct≥40 adalah negatif;

2. Ct<37 adalah positif;

3. Nilai Ct 37-40 ialah kawasan skala kelabu.Adalah disyorkan untuk mengulangi eksperimen.Jika keputusan membuat semula Ct<40 dan lengkung amplifikasi mempunyai kemuncak yang jelas, sampel dinilai sebagai positif, jika tidak, ia adalah negatif."

Panduan edisi ketiga dan panduan edisi keempat meneruskan kriteria di atas.Walau bagaimanapun, disebabkan oleh sasaran berbeza yang digunakan dalam kit komersial, edisi ke-3 panduan yang disebutkan di atas tidak memberikan kriteria untuk menentukan gabungan sasaran, menekankan Arahan yang diberikan oleh pengilang akan diutamakan.Bermula dari garis panduan edisi kelima, dua sasaran telah diperjelaskan terutamanya kriteria penghakiman bagi satu sasaran yang sukar dinilai.Iaitu, jika makmal ingin mengesahkan bahawa kes positif pengesanan asid nukleik SARS-CoV-2, perkara berikut perlu dipenuhi 1 daripada 2 syarat:

(1) Dua sasaran SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) dalam sampel yang sama diuji positif oleh RT-PCR pendarfluor masa nyata.Jika sasaran tunggal adalah positif, pensampelan semula dan ujian semula diperlukan.Jika keputusan ujian adalah Jika sasaran tunggal masih positif, ia dinilai sebagai positif.

(2) Dua sampel RT-PCR pendarfluor masa nyata menunjukkan sasaran tunggal positif pada masa yang sama atau dua sampel jenis yang sama menunjukkan hasil ujian positif sasaran tunggal, yang boleh dinilai sebagai positif.Walau bagaimanapun, garis panduan itu juga menekankan bahawa keputusan negatif ujian asid nukleik tidak boleh mengecualikan jangkitan SARS-CoV-2.Faktor yang boleh menyebabkan negatif palsu perlu dikecualikan, termasuk kualiti sampel yang lemah (sampel pernafasan dari orofarinks dan bahagian lain), pengumpulan sampel terlalu awal atau terlambat, Sampel tidak disimpan, diangkut dan diproses dengan betul, dan teknologi itu sendiri mempunyai masalah (variasi virus, perencatan PCR), dsb.

Punca negatif palsu dalam pengesanan SARS-CoV-2

Konsep "negatif palsu" dalam ujian asid nukleik yang menjadi perhatian pada masa ini, sering merujuk kepada "negatif palsu" di mana keputusan ujian asid nukleik tidak konsisten dengan manifestasi klinikal, iaitu gejala klinikal dan keputusan pengimejan sangat disyaki COVID-19, tetapi ujian asid nukleik sentiasa "negatif" berkali-kali.Pusat Makmal Klinikal Suruhanjaya Kesihatan Kebangsaan menjelaskan ujian SARS-CoV-2 "negatif palsu".

(1) Terdapat sejumlah virus dalam sel orang yang dijangkiti.Data sedia ada menunjukkan bahawa selepas badan dijangkiti virus, virus memasuki kerongkong melalui hidung dan mulut, kemudian ke trakea dan bronkus, dan kemudian sampai ke alveoli.Orang yang dijangkiti akan mengalami tempoh inkubasi, gejala ringan, dan kemudian proses gejala teruk, dan peringkat penyakit yang berbeza.Dan jumlah virus yang terdapat di bahagian tubuh yang berlainan adalah berbeza.

Dari segi beban virus jenis sel, sel epitelium alveolar (saluran pernafasan bawah)> sel epitelium saluran udara (saluran pernafasan atas)> fibroblas, sel endothelial, dan makrofaj, dsb.;daripada jenis sampel, cecair lavage alveolar (paling Cemerlang)>kahak batuk dalam>sapu nasofaring>sapu oropharyngeal>darah.Selain itu, virus juga boleh dikesan dalam najis.Walau bagaimanapun, mengambil kira kemudahan operasi dan penerimaan pesakit, susunan sampel klinikal yang biasa digunakan ialah swab oropharyngeal>swap nasofaring>cecair lavage bronkial (operasi kompleks) dan kahak dalam (biasanya batuk kering, sukar diperoleh).

Oleh itu, jumlah virus dalam sel-sel orofarinks atau nasofaring sesetengah pesakit adalah kecil atau sangat rendah.Jika hanya sampel orofarinks atau nasofaring diambil untuk ujian, asid nukleik virus tidak akan dikesan.

(2) Tiada sel yang mengandungi virus dikumpulkan semasa pengumpulan sampel, atau asid nukleik virus tidak dipelihara dengan berkesan.

[① Tapak pengumpulan yang tidak betul, contohnya, apabila mengumpul swab orofarinks, kedalaman pengumpulan tidak mencukupi, swab nasofaring yang dikumpul tidak dikumpulkan jauh di dalam rongga hidung, dll. Kebanyakan sel yang dikumpul mungkin sel bebas virus;

②Sampling swab digunakan dengan tidak betul.Sebagai contoh, gentian sintetik seperti gentian PE, gentian poliester dan gentian polipropilena disyorkan untuk bahan kepala swab.Gentian semulajadi seperti kapas digunakan dalam operasi sebenar (penjerapan protein yang kuat dan tidak mudah dibasuh) Dan gentian nilon (penyerapan air yang lemah, menyebabkan jumlah pensampelan tidak mencukupi);

③Penggunaan tiub penyimpanan virus yang salah, seperti penyalahgunaan tiub penyimpanan plastik polipropilena atau polietilena yang mudah menyerap asid nukleik (DNA/RNA), mengakibatkan penurunan kepekatan asid nukleik dalam larutan simpanan.Dalam amalan, adalah disyorkan untuk menggunakan plastik polimer polietilena-propilena dan beberapa bekas plastik polipropilena yang dirawat khas untuk menyimpan asid nukleik virus.]

[① Tapak pengumpulan yang tidak betul, contohnya, apabila mengumpul swab orofarinks, kedalaman pengumpulan tidak mencukupi, swab nasofaring yang dikumpul tidak dikumpulkan jauh di dalam rongga hidung, dll. Kebanyakan sel yang dikumpul mungkin sel bebas virus;

②Sampling swab digunakan dengan tidak betul.Sebagai contoh, gentian sintetik seperti gentian PE, gentian poliester dan gentian polipropilena disyorkan untuk bahan kepala swab.Gentian semulajadi seperti kapas digunakan dalam operasi sebenar (penjerapan protein yang kuat dan tidak mudah dibasuh) Dan gentian nilon (penyerapan air yang lemah, menyebabkan jumlah pensampelan tidak mencukupi);

③Penggunaan tiub penyimpanan virus yang salah, seperti penyalahgunaan tiub penyimpanan plastik polipropilena atau polietilena yang mudah menyerap asid nukleik (DNA/RNA), mengakibatkan penurunan kepekatan asid nukleik dalam larutan simpanan.Dalam amalan, adalah disyorkan untuk menggunakan plastik polimer polietilena-propilena dan beberapa bekas plastik polipropilena yang dirawat khas untuk menyimpan asid nukleik virus.]

(4) Operasi makmal klinikal tidak diseragamkan.Contoh keadaan pengangkutan dan penyimpanan, operasi standard makmal klinikal, tafsiran keputusan dan kawalan kualiti adalah faktor utama untuk memastikan ketepatan dan kebolehpercayaan keputusan ujian.Mengikut keputusan penilaian kualiti luaran yang dijalankan oleh Pusat Makmal Klinikal Suruhanjaya Kesihatan Kebangsaan pada 16-24 Mac 2020, daripada 844 makmal yang menerima keputusan yang sah, 701 (83.1%) layak, dan 143 (16.9%) tidak.Berkelayakan, keadaan ujian makmal keseluruhan adalah baik, tetapi makmal yang berbeza masih mempunyai perbezaan dalam keupayaan operasi kakitangan, keupayaan tafsiran sampel positif sasaran tunggal, dan kawalan kualiti.

Bagaimana untuk mengurangkan negatif palsu pengesanan asid nukleik SARS-CoV-2?

Mengurangkan negatif palsu dalam pengesanan asid nukleik harus dioptimumkan daripada empat aspek menghasilkan negatif palsu.

(1) Terdapat sejumlah virus dalam sel orang yang dijangkiti.Kepekatan virus di bahagian tubuh yang berlainan bagi orang yang disyaki dijangkiti akan berbeza pada masa yang berbeza.Jika tiada farinks, ia mungkin berada dalam cecair lavage bronkial atau najis.Jika berbilang jenis sampel boleh dikumpulkan pada masa yang sama atau pada peringkat perkembangan penyakit yang berbeza untuk ujian, Akan membantu mengelakkan negatif palsu.

(2) Sel yang mengandungi virus hendaklah dikumpul semasa pengumpulan sampel.Masalah ini boleh diselesaikan secara besar-besaran dengan memantapkan latihan pengumpul sampel.

(3) Reagen IVD yang boleh dipercayai.Dengan menjalankan penyelidikan mengenai penilaian prestasi pengesanan reagen di peringkat kebangsaan, dan membincangkan masalah yang sedia ada, kecekapan pengesanan reagen dapat dipertingkatkan lagi dan sensitiviti analisis dapat dipertingkatkan.

(4) Operasi standard makmal klinikal.Dengan mengukuhkan latihan kakitangan makmal, menambah baik sistem pengurusan kualiti makmal secara berterusan, memastikan pembahagian yang munasabah, dan meningkatkan keupayaan kakitangan untuk mengesan, adalah mungkin untuk mengurangkan negatif palsu disebabkan oleh operasi makmal yang tidak betul.

Sebab untuk ujian semula positif ujian asid nukleik SARS-CoV-2 dalam pesakit yang pulih dan discaj

“Pelan Diagnosis dan Rawatan COVID-19 (Edisi Ketujuh Percubaan)” dengan jelas menetapkan bahawa salah satu kriteria pesakit COVID-19 untuk sembuh dan dibenarkan keluar dari hospital ialah dua sampel saluran pernafasan berturut-turut mempunyai ujian asid nukleik negatif (sekurang-kurangnya 24 jam), tetapi terdapat sangat sedikit pesakit SARS-CoV-2 yang menjalani ujian asid nukleik positif semula kerana pelbagai sebab untuk ujian asid nukleik.

(1)SARS-CoV-2 ialah virus baharu.Ia adalah perlu untuk memahami lebih lanjut mekanisme patogeniknya, gambaran penuh penyakit yang disebabkan dan ciri-ciri perjalanan penyakit.Oleh itu, di satu pihak, adalah perlu untuk mengukuhkan pengurusan pesakit yang discaj dan menjalankan pemerhatian perubatan selama 14 hari.Menjalankan susulan, pemantauan kesihatan dan bimbingan kesihatan untuk mendalami pemahaman tentang keseluruhan proses kejadian, perkembangan dan kesudahan penyakit.

(2) Pesakit mungkin dijangkiti virus itu semula.Ahli akademik Zhong Nanshan berkata: Oleh kerana pesakit yang sembuh mempunyai antibodi, SARS-CoV-2 boleh disingkirkan oleh antibodi apabila mereka menyerang semula.Terdapat banyak sebab, yang mungkin menjadi punca pesakit pulih, atau mungkin berkaitan dengan mutasi virus, atau pun punca ujian makmal.Jika virus itu sendiri, mutasi SARS-CoV-2 mungkin menyebabkan antibodi yang dihasilkan oleh pesakit yang pulih tidak berkesan terhadap virus bermutasi.Jika pesakit dijangkiti virus bermutasi lagi, ujian asid nukleik mungkin positif semula.

(3) Setakat kaedah ujian makmal, setiap kaedah ujian mempunyai hadnya.Pengesanan asid nukleik SARS-CoV-2 adalah disebabkan oleh pilihan jujukan gen, komposisi reagen, sensitiviti kaedah dan sebab lain, yang membawa kepada kit sedia ada mempunyai had pengesanan yang lebih rendah.Selepas pesakit dirawat, virus dalam badan berkurangan.Apabila viral load dalam sampel yang akan diuji berada di bawah had pengesanan yang lebih rendah, keputusan "negatif" akan muncul.Walau bagaimanapun, keputusan ini tidak bermakna virus dalam badan telah hilang sepenuhnya.Virus mungkin selepas rawatan dihentikan.Kebangkitan semula”, terus menyalin.Oleh itu, adalah disyorkan untuk menyemak sekali seminggu dalam tempoh 2 hingga 4 minggu selepas keluar.

(4) Asid nukleik ialah bahan genetik virus.Virus itu dibunuh selepas pesakit menjalani rawatan antivirus, tetapi serpihan RNA virus yang tinggal masih dikekalkan di dalam tubuh manusia, dan tidak dilepaskan sepenuhnya dari badan.Kadangkala, dalam keadaan tertentu, ia boleh lebih dikekalkan.Lama, dan pada masa ini ujian asid nukleik akan menjadi positif "sementara".Dengan lanjutan masa pemulihan pesakit, selepas serpihan RNA sisa dalam badan secara beransur-ansur habis, keputusan ujian asid nukleik boleh bertukar negatif.

(5) Keputusan ujian asid nukleik SARS-CoV-2 hanya membuktikan kehadiran atau ketiadaan RNA virus, dan tidak dapat membuktikan aktiviti virus dan sama ada virus itu boleh ditularkan.Adalah perlu untuk membuktikan sama ada pesakit yang mempunyai ujian asid nukleik positif semula akan menjadi sumber jangkitan semula.Ia adalah perlu untuk menjalankan kultur virus pada sampel klinikal dan memupuk virus "hidup" untuk membuktikan bahawa ia berjangkit.

Ringkasan

Ringkasnya, ujian asid nukleik SARS-CoV-2 negatif palsu, ujian semula positif dan keadaan lain yang tidak konsisten dengan manifestasi klinikal tidak boleh dielakkan sepenuhnya.Dalam saringan dan ujian sebenar, adalah disyorkan untuk menggabungkan simptom klinikal, pemeriksaan pengimejan (CT) dan eksperimen Keputusan ujian makmal (ujian asid nukleik + ujian antibodi khusus virus) untuk diagnosis komprehensif untuk mengelakkan diagnosis terlepas dan salah diagnosis.Jika keputusan ujian didapati jelas tidak konsisten dengan manifestasi klinikal, adalah disyorkan untuk menjalankan analisis komprehensif bagi keseluruhan pautan ujian (pautan pengumpulan sampel, peredaran dan pemprosesan) untuk mengecualikan jangkitan awal virus SARS-CoV-2, jangkitan berulang atau digabungkan dengan jangkitan virus pernafasan lain, dsb.Jika keadaan membenarkan, adalah disyorkan untuk mengumpul sampel yang lebih sensitif seperti kahak atau cecair lavage alveolar untuk pemeriksaan semula.

Produk Berkaitan:

Kit Pengesanan Asid Nukleik SARS-CoV-2 (Kaedah Pendarfluor Multiplex PCR)