PCR langsung ialah tindak balas yang secara langsung menggunakan tisu haiwan atau tumbuhan untuk amplifikasi tanpa pengekstrakan asid nukleik.Dalam banyak cara, PCR langsung berfungsi seperti PCR biasa

Perbezaan utama ialah penimbal tersuai yang digunakan dalam PCR langsung, sampel boleh terus tertakluk kepada tindak balas PCR tanpa pengekstrakan asid nukleik, tetapi terdapat keperluan yang sepadan untuk toleransi enzim dan keserasian penimbal yang terlibat dalam tindak balas PCR langsung.

Walaupun terdapat lebih kurang perencat PCR dalam sampel biasa, PCR langsung masih boleh mencapai amplifikasi yang boleh dipercayai di bawah tindakan enzim dan penimbal.Tindak balas PCR tradisional memerlukan asid nukleik berkualiti tinggi sebagai templat, yang boleh menghalang kelancaran tindak balas PCR jika templat mengandungi protein dan kekotoran lain.PCR langsung kini merupakan salah satu teknologi yang lebih popular dalam bidang diagnostik molekul.

01 Direct PCR pada asalnya digunakan untuk haiwan dan tumbuhan

Aplikasi terawal PCR langsung adalah dalam bidang haiwan dan tumbuh-tumbuhan, seperti darah, tisu dan rambut tikus, kucing, ayam, arnab, biri-biri, lembu, dsb., daun dan biji tumbuhan, dsb., digunakan untuk mengkaji genotaip, transgenik, pengesanan plasmid, analisis kalah mati gen, pengenalpastian sumber DNA, pengenalpastian spesies, analisis medan SNP dan lain-lain.

Bidang-bidang ini mempunyai beberapa ciri biasa, iaitu kandungan gen sasaran agak tinggi dan pengekstrakan asid nukleik menyusahkan, jadi PCR langsung bukan sahaja dapat menjimatkan masa dan memberi kesan yang kecil kepada hasilnya, tetapi juga menjimatkan kos.

PCR langsung yang digunakan untuk pengesanan patogen adalah beberapa tahun kebelakangan ini, beberapa pengeluar reagen PCR telah melakukan banyak usaha ke arah ini apabila membuat inovasi.Terutamanya dalam wabak COVID-19 ini, banyak produk pengesanan seperti itu telah muncul di pasaran, seperti Kit Pengesanan Asid Nukleik SARS-CoV-2 (Kaedah Pendarfluor Multiplex PCR) yang diselidik dan dibangunkan oleh Foregene, yang menggunakan teknologi RT PCR masa Nyata (rRT-PCR) untuk pengesanan kualitatif bagi SARS-CoV-2, sampel nasofaring atau asid nasofaring manusia.

Foregene ialah salah satu syarikat yang menggunakan teknologi Direct PCR, untuk pengesanan ORF1ab, N, E danpelbagai garis keturunan asid nukleik dalam sampel swab nasofaring atau orofarinks manusia seperti keturunan SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), keturunan B.1.351 (ZA), keturunan B.1.617 (IND) dan keturunan P.1 (BR).

02  Reagen diperlukan untuk PCR langsung

Contoh Lysate

Lisat sampel boleh dikonfigurasikan sendiri atau dibeli.Perbezaan dalam komposisi jenama lysate yang berbeza akan menjadikan keupayaan lysing berbeza, dan kemudian masa lysing akan sedikit berbeza.Sebagai contoh, untuk penyediaan sampel tisu haiwan, 30 minit atau lisis semalaman biasanya disyorkan, dan penyelesaian lisis untuk virus berjulat antara 3-10 minit.

Campuran induk PCR

Adalah disyorkan untuk menggunakan polimerase DNA permulaan panas untuk meningkatkan amplifikasi khusus dan meningkatkan keupayaan amplifikasi.Teras PCR langsung ialah polimerase yang sangat bertoleransi.

Menghapuskan atau menghalang komponen dalam sampel yang menjejaskan penguatan DNA

Selepas sampel diproses dengan lysate, protein, lipid dan serpihan sel lain akan dibebaskan, bahan-bahan ini akan menghalang tindak balas PCR.Oleh itu, PCR langsung memerlukan penambahan penyingkiran atau perencat yang sepadan untuk mengurangkan pengaruh faktor-faktor ini.

03  Koleksi lima mata pengetahuan PCR langsung

Pertama, teknologi Direct PCR ialah teknologi PCR langsung untuk pelbagai sampel biologi.Di bawah keadaan teknikal ini, tidak ada keperluan untuk memisahkan dan mengekstrak asid nukleik, secara langsung menggunakan sampel tisu sebagai objek, dan menambah primer gen sasaran adalah untuk melakukan tindak balas PCR.

Kedua, teknologi Direct PCR bukan sahaja teknologi amplifikasi templat DNA tradisional, tetapi juga termasuk PCR transkripsi terbalik templat RNA.

Ketiga, teknologi Direct PCR bukan sahaja secara langsung melakukan tindak balas PCR kualitatif rutin pada sampel tisu, tetapi juga termasuk tindak balas qPCR Masa Nyata, yang memerlukan sistem tindak balas mempunyai keupayaan gangguan pendarfluor anti-latar belakang yang kuat dan pendarfluor endogen memadamkan keupayaan antagonis.

Keempat, sampel yang disasarkan oleh teknologi Direct PCR hanya memerlukan pembebasan templat asid nukleik, dan tidak mengeluarkan protein, polisakarida, ion garam, dan lain-lain yang mengganggu tindak balas PCR.Yang memerlukan asid nukleik polimerase dan Campuran PCR dalam sistem tindak balas mempunyai rintangan dan kebolehsuaian yang sangat baik untuk memastikan aktiviti enzim dan ketepatan replikasi dalam keadaan yang kompleks.

Kelima, sampel tisu yang disasarkan oleh teknologi Direct PCR tanpa sebarang rawatan pengayaan asid nukleik dan jumlah templat adalah sangat kecil, yang memerlukan sistem tindak balas mempunyai sensitiviti dan kecekapan amplifikasi yang sangat tinggi.