Saya percaya bahawa setiap orang akan sentiasa menghadapi masalah sebegitu atau sebegitu apabila melakukan tindak balas PCR, tetapi kebanyakannya boleh diklasifikasikan kepada dua masalah utama:

Terlalu sedikit amplifikasi templat gen (amplifikasi);
Terlalu banyak amplifikasi gen bukan sasaran.
Menggunakan bahan tambahan adalah salah satu strategi biasa untuk menyelesaikan masalah ini.Biasanya peranan aditif mempunyai dua aspek:
struktur sekundergen (struktur sekunder);
Kurangkan penyebuan tidak khusus.
Hari ini, editor akan memperkenalkan secara ringkas kepada anda bahan tambahan biasa dalam tindak balas PCR dan fungsinya.
Aditif yang mengurangkan struktur sekunder
sulfoksida(DMSO)
sampel gendengan kandungan GC yang tinggi.Walau bagaimanapun, DMSO juga sangat mengurangkan aktiviti polimerase Taq.Oleh itu, setiap orang perlu mengimbangi kebolehcapaian templat dan aktiviti polimerase.Editor mencadangkan anda boleh mencuba kepekatan DSMO yang berbeza, seperti dari 2% hingga 10%, untuk mencari kepekatan yang sesuai dengan percubaan anda.
Detergen bukan ionik
Detergen bukan ionik, seperti 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 atau NP-40, biasanya mengurangkan struktur sekunder DNA.Walaupun ini boleh meningkatkan penguatan gen templat, ia juga akan menyebabkan masalah penguatan bukan khusus.Jadi, bahan tambahan ini berfungsi dengan baik untuk tindak balas PCR hasil rendah tanpa serpihan, tetapi tidak begitu baik untuk tindak balas PRC yang agak tidak tulen.Satu lagi faedah detergen bukan ionik ialah pengurangan pencemaran SDS.Biasanya semasa proses pengekstrakan DNA, SDS akan dibawa ke langkah PCR, yang sangat menghalang aktiviti polimerase.Oleh itu, menambah 0.5% Tween-20 atau Tween-40 kepada tindak balas boleh meneutralkan kesan negatif SDS.
Betaine_
Betaine boleh meningkatkan penguatan DNA dengan mengurangkan pembentukan struktur sekunder dan secara amnya merupakan tambahan "misteri" kepada kit PCR komersial.Jika anda ingin menggunakan betaine, anda harus meletakkan betaine atau betaine mono-hydrate (Betaine atau Betaine mono-hydrate), tetapi bukan betaine hydrochloride (Betaine HCl), laraskan kepada kepekatan akhir 1-1.7M.Betaine juga boleh membantu meningkatkan kekhususan kerana ia menghapuskan pergantungan komposisi pasangan asas daripada peleburan DNA/denaturasi DNA.
Aditif untuk mengurangkan penyebuan tidak spesifik
Formamide
Formamide ialah bahan tambahan PCR organik yang biasa digunakan.Ia boleh bergabung dengan alur utama dan alur kecil dalam DNA, dengan itu mengurangkan kestabilan heliks berganda DNA induk dan menurunkan suhu lebur DNA.Kepekatan formamide yang digunakan dalam eksperimen PCR biasanya 1%-5%.
Tetrametilammonium klorida( TMAC)
Tetramethylammonium chloride boleh meningkatkan kekhususan hibridisasi (kekhususan hibridisasi) dan meningkatkan suhu lebur DNA.Oleh itu, TMAC boleh membuang penyebuan tidak spesifik dan mengurangkan salah ikatan DNA dan RNA.Jika anda menggunakanprimer yang merosotdalam tindak balas PCR, ingat untuk menambah TMAC, yang biasanya digunakan pada kepekatan 15-100mM.
Bahan Tambahan Biasa Lain
Sebagai tambahan kepada dua kategori aditif yang disebutkan di atas, terdapat banyak aditif biasa dalam tindak balas PCR, walaupun ia mempunyai fungsi yang berbeza, ia juga sangat penting.
Ion magnesium
Ion magnesium ialah kofaktor (kofaktor) polimerase yang sangat diperlukan, iaitu, tanpa ion magnesium, polimerase tidak aktif.Walau bagaimanapun, terlalu banyak ion magnesium juga boleh menjejaskan kecekapan polimerase.Kepekatan ion magnesium dalam setiap tindak balas PCR akan berbeza-beza.Ejen kelat (seperti EDTA atau sitrat), kepekatan dNTP dan protein semuanya mempengaruhi kepekatan ion magnesium.Jadi, jika anda menghadapi masalah dengan percubaan PCR anda, anda boleh cuba menukar kepekatan ion magnesium yang berbeza, contohnya, daripada 1.0 kepada 4.0mM, dengan selang 0.5–1mM di antaranya.
Perlu diingat bahawa berbilang kitaran pencairan beku boleh membawa kepada stratifikasi kepekatan larutan magnesium klorida.Oleh itu, anda mesti melarutkannya sepenuhnya sebelum setiap penggunaan, dan campurkan dengan baik sebelum menggunakannya.
Albumin serum lembu(albumin lembu, BSA)
Dalam eksperimen kimia molekul, albumin serum lembu adalah bahan tambahan yang sangat biasa, terutamanya dalam penghadaman enzim sekatan dan eksperimen PCR.Dalam tindak balas PCR, BSA membantu dalam mengurangkan bahan cemar seperti sebatian fenolik.Dan ia juga dikatakan boleh mengurangkan lekatan bahan tindak balas pada dinding tabung uji.Dalam tindak balas PCR, biasanya kepekatan BSA yang ditambah boleh mencapai 0.8 mg/ml.
 
Produk Berkaitan:
Wira PCR(dengan pewarna)
Wira PCR