Dalam eksperimen qPCR, reka bentuk primer juga merupakan pautan yang sangat penting.Sama ada primer sesuai atau tidak adalah berkait rapat dengan sama ada kecekapan amplifikasi mencapai standard, sama ada produk yang dikuatkan adalah khusus dan sama ada keputusan percubaan tersedia.
Jadi bagaimana untuk menjadikan kekhususan primer qPCR lebih baik?Kecekapan amplifikasi yang tinggi?
Hari ini, kami akan membawa anda untuk mereka bentuk primer qPCR bersama-sama, dan membiarkan reka bentuk primer qPCR menjadi kemahiran pengetahuan yang cekap dalam eksperimen.
Apabila mereka bentuk primer qPCR, biasanya memberi perhatian kepada perkara berikut: primer hendaklah direka bentuk merentas intron sebanyak mungkin, panjang produk hendaklah 100-300 bp, nilai Tm hendaklah sehampir mungkin kepada 60°C, dan primer huluan dan hiliran hendaklah sedekat mungkin, dan hujung primer hendaklah G atau C, dsb. tunggu.
1. Reka bentuk primer yang merangkumi intron
Apabila mereka bentuk primer qPCR, memilih primer yang direka merentas intron boleh menghalang templat gDNA daripada dikuatkan, dan produk semuanya diperoleh daripada penguatan cDNA, sekali gus menghapuskan pengaruh pencemaran gDNA.
2. Panjang primer
Panjang primer biasanya antara 18-30 nt, dan panjang produk amplifikasi harus dikawal antara 100-300 bp sebanyak mungkin.
Jika buku asas terlalu pendek, ia akan membawa kepada penguatan tidak spesifik, dan jika terlalu panjang, ia akan dengan mudah membentuk struktur sekunder (seperti struktur jepit rambut).Jika produk amplifikasi terlalu panjang, ia tidak sesuai untuk tindak balas polimerase, yang akan menjejaskan kecekapan amplifikasi PCR.
3. Kandungan GC dan nilai Tm
Kandungan GC primer harus dikawal antara 40% dan 60%.Jika ia terlalu tinggi atau terlalu rendah, ia tidak kondusif untuk memulakan tindak balas.Kandungan GC primer hadapan dan belakang hendaklah hampir sama untuk mendapatkan nilai Tm dan suhu penyepuhlindapan yang sama.
Nilai Tm hendaklah antara 55-65°C sejauh mungkin, secara amnya sekitar 60°C, dan nilai Tm hulu dan hilir hendaklah sedekat mungkin, sebaik-baiknya tidak melebihi 4°C.
4. Elakkan memilih A pada hujung 3′ primer
Apabila hujung 3′ primer tidak sepadan, terdapat perbezaan besar dalam kecekapan sintesis asas yang berbeza.Apabila asas terakhir ialah A, ia juga boleh memulakan sintesis rantai walaupun dalam kes ketidakpadanan, dan apabila asas terakhir ialah T Apabila , kecekapan induksi ketidakpadanan dikurangkan dengan banyaknya.Oleh itu, cuba elakkan memilih A pada hujung 3′ primer, dan lebih baik memilih T.
Jika ia adalah primer probe, hujung 5′ probe tidak boleh menjadi G, kerana walaupun satu pangkalan G disambungkan kepada kumpulan wartawan pendarfluor FAM, G juga boleh memadamkan isyarat pendarfluor yang dipancarkan oleh kumpulan FAM, mengakibatkan keputusan negatif palsu.Muncul.
5. Pengagihan asas
Taburan empat asas dalam primer adalah sebaik-baiknya rawak, mengelakkan lebih daripada 3 G atau C berturut-turut pada hujung 3′, dan lebih daripada 3 berturut-turut.G atau C mudah untuk menjana gandingan dalam rantau jujukan yang kaya dengan GC.
6. Kawasan reka bentuk primer harus mengelakkan struktur sekunder yang kompleks.
Struktur sekunder yang dibentuk oleh helai tunggal produk amplifikasi akan menjejaskan kemajuan lancar PCR.Dengan meramalkan sama ada terdapat struktur sekunder dalam jujukan sasaran terlebih dahulu, cuba elakkan rantau ini dalam reka bentuk primer.
7. Primer itu sendiri dan antara primer harus cuba mengelakkan asas pelengkap yang berturutan.
Tidak boleh ada komplementari 4 asas berturut-turut antara primer itu sendiri dan primer.Primer itu sendiri tidak sepatutnya mempunyai urutan pelengkap, jika tidak, ia akan melipat dirinya untuk membentuk struktur jepit rambut, yang akan menjejaskan gabungan penyepuhlindapan primer dan templat.
Urutan pelengkap tidak boleh wujud antara primer huluan dan hiliran.Pelengkap antara primer akan menghasilkan dimer primer, yang akan mengurangkan kecekapan PCR dan juga menjejaskan ketepatan kuantitatif.Jika struktur primer-dimer dan jepit rambut tidak dapat dielakkan, nilai △G tidak boleh terlalu tinggi (sepatutnya kurang daripada 4.5 kcal/mol).
8. Primer menguatkan produk khusus sasaran.
Matlamat utama pengesanan qPCR adalah untuk memahami banyaknya gen sasaran.Jika penguatan bukan khusus berlaku, kuantifikasi akan menjadi tidak tepat.Oleh itu, selepas primer direka bentuk, ia perlu diuji oleh BLAST, dan kekhususan produk dibandingkan dalam pangkalan data jujukan.
Seterusnya, kami mengambil gen manusia GAS6 (Growth arrest specific 6) sebagai contoh untuk mereka bentuk primer qPCR.
01 gen pertanyaan
Homo GAS6melalui NCBI.Di sini, kita harus memberi perhatian untuk membandingkan nama gen dan spesies untuk memastikan ia konsisten.
02 Cari jujukan gen
(1) Jika jujukan sasaran ialah DNA genomik, pilih yang pertama, iaitu jujukan DNA genomik gen.
(2) Jika jujukan sasaran ialah mRNA, pilih yang kedua.Selepas memasukkan, klik "CDS" dalam jadual di bawah.Urutan latar belakang coklat ialah urutan pengekodan gen.
03 Reka bentuk primer
Masukkan antara muka Primer-BLAST
Masukkan nombor jujukan gen atau jujukan dalam format Fasta di sebelah kiri atas, dan isikan parameter yang berkaitan.

Klik "Dapatkan primer" dan NCBI akan muncul untuk memberitahu anda bahawa pemilihan parameter tersebut akan dikuatkan kepada varian penyambungan lain.Kami boleh menyemak variasi penyambungan yang berbeza dan menyerahkannya untuk mendapatkan pasangan primer yang sesuai (seperti yang ditunjukkan dalam rajah di bawah).Proses ini mungkin mengambil masa berpuluh-puluh saat untuk dijalankan.
Suhu penyepuhlindapan pasangan primer ini adalah sekitar 60°C.Mengikut tujuan eksperimen, pilih primer dengan panjang sederhana, kekhususan yang baik dan kurang pelengkapan diri primer untuk eksperimen, dan kadar kejayaannya agak tinggi!
04Pengesahan kekhususan primer
Malah, selain mereka bentuk primer, Primer-Blast juga boleh menilai primer yang kami reka sendiri.Kembali ke halaman reka bentuk primer, masukkan primer huluan dan hiliran yang kami reka bentuk dan parameter lain tidak akan dilaraskan.Selepas menyerahkan, anda boleh melihat sama ada pasangan primer juga wujud pada gen lain.Jika kesemuanya dipaparkan pada gen yang ingin kami kuatkan , menunjukkan bahawa kekhususan pasangan primer ini hebat!(Sebagai contoh, ini adalah satu-satunya hasil pertanyaan primer!)

05 Pertimbangan kualiti primer
Apakah jenis primer adalah buku asas "sempurna" yang menggabungkan "kecekapan penguatan sehingga standard", "ciri produk yang diperkuatkan" dan "hasil percubaan yang boleh dipercayai"?
Kecekapan penguatan

lengkung lebur
Kecekapan amplifikasi primer mencapai 90% -110%, yang bermaksud bahawa kecekapan amplifikasi adalah baik, dan lengkung lebur mempunyai puncak tunggal dan biasanya Tm> 80 ° C, yang bermaksud bahawa kekhususan amplifikasi adalah baik.
 
Produk Berkaitan:
Mudah PCR Masa Nyata–SYBR GREEN I
Mudah-Taqman PCR Masa Nyata