Kehilangan pendengaran (HL) adalah penyakit kecacatan deria yang paling biasa pada manusia.Di negara maju, kira-kira 80% kes pekak prabahasa pada kanak-kanak disebabkan oleh faktor genetik.Yang paling biasa adalah kecacatan gen tunggal (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1), 124 mutasi gen didapati dikaitkan dengan kehilangan pendengaran bukan sindrom pada manusia, selebihnya disebabkan oleh faktor persekitaran.Implan koklea (alat elektronik yang diletakkan di telinga dalam yang memberikan rangsangan elektrik terus ke saraf pendengaran) adalah pilihan yang paling berkesan untuk merawat HL yang teruk, manakala alat bantuan pendengaran (peranti elektronik luaran yang menukar dan menguatkan gelombang bunyi) boleh membantu Pesakit dengan HL sederhana.Walau bagaimanapun, pada masa ini tiada ubat yang tersedia untuk merawat HL (GHL) keturunan.Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, terapi gen telah mendapat perhatian yang semakin meningkat sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk merawat disfungsi telinga dalam.

Rajah 1.Taburan jenis variasi yang berkaitan dengan pekak.[1]

Baru-baru ini, saintis dari Institut Salk dan Universiti Sheffield menerbitkan hasil penyelidikan dalam Terapi Molekul - Kaedah & Pembangunan Klinikal [2], yang menunjukkan prospek aplikasi yang luas untuk terapi gen in vivo bagi pekak keturunan.Uri Manor, penolong profesor penyelidikan di Institut Salk dan pengarah Waitt Center for Advanced Biophotonics, berkata dia dilahirkan dengan kehilangan pendengaran yang teruk dan merasakan memulihkan pendengaran akan menjadi hadiah yang indah.Penyelidikan beliau sebelum ini mendapati bahawa Eps8 ialah protein pengawalseliaan aktin dengan aktiviti mengikat dan menyekat aktin;dalam sel rambut koklea, kompleks protein yang dibentuk oleh Eps8 dengan MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 dan GNAI3 terutamanya wujud dalam kebanyakan Petua stereocilia panjang, yang bersama-sama dengan MYO15A menyetempatkan BAIAP2L2 pada hujung stereocilia yang lebih pendek, diperlukan untuk penyelenggaraan berkas rambut.Oleh itu, Eps8 boleh mengawal panjang stereocilia sel rambut, yang penting untuk fungsi pendengaran normal;Pemadaman atau mutasi Eps8 akan membawa kepada stereocilia pendek, yang menjadikannya tidak dapat menukar bunyi dengan betul kepada isyarat elektrik untuk persepsi otak, yang seterusnya membawa kepada pekak..Pada masa yang sama, kolaborator Walter Marcotti, seorang profesor di Universiti Sheffield, mendapati bahawa sel rambut tidak dapat berkembang secara normal tanpa adanya Eps8.Dalam kajian ini, Manor dan Marcotti bekerjasama untuk menyiasat sama ada menambah Eps8 pada sel stereociliary boleh memulihkan fungsinya dan, seterusnya, meningkatkan pendengaran pada tikus.Pasukan penyelidik menggunakan vektor virus berkaitan adeno (AAV) Anc80L65 untuk menyampaikan urutan pengekodan yang mengandungi EPS8 jenis liar ke dalam koklea Eps8-/- tikus P1-P2 yang baru lahir melalui suntikan membran tingkap bulat;dalam sel rambut koklea tetikus Fungsi stereocilia telah dibaiki sebelum ia matang;dan kesan pembaikan dicirikan oleh teknologi pengimejan dan pengukuran stereocilia.Keputusan menunjukkan bahawa Eps8 meningkatkan panjang stereocilia dan memulihkan fungsi sel rambut dalam sel frekuensi rendah.Mereka juga mendapati bahawa, dari masa ke masa, sel-sel kelihatan kehilangan keupayaan mereka untuk diselamatkan oleh terapi gen ini.Implikasinya ialah rawatan ini mungkin perlu diberikan dalam rahim, kerana sel rambut Eps8-/- mungkin telah matang atau terkumpul kerosakan yang tidak dapat dibaiki selepas tikus dilahirkan."Eps8 ialah protein dengan banyak fungsi berbeza, dan masih banyak yang perlu diterokai," kata Manor.Penyelidikan masa depan akan termasuk menyiasat kesan terapi gen Eps8 dalam memulihkan pendengaran pada peringkat perkembangan yang berbeza, dan sama ada kemungkinan untuk memanjangkan peluang rawatan.Secara kebetulan, pada November 2020, Profesor KarenB Avraham dari Universiti Tel Aviv di Israel menerbitkan keputusannya dalam jurnal EMBO Molecular Medicine [3], menggunakan teknologi terapi gen yang inovatif untuk mencipta virus AAV9-PHP yang berkaitan dengan adeno sintetik yang tidak berbahaya.B, Kecacatan gen dalam sel rambut tikus Syne4-/- telah dibaiki dengan menyuntik virus yang membawa urutan pengekodan Syne4 ke dalam telinga dalam tikus, membolehkannya memasuki sel rambut dan melepaskan bahan genetik yang dibawa, membolehkan mereka matang dan berfungsi secara normal (seperti dalam Rajah 2).

Rajah 2.Perwakilan skematik anatomi telinga dalam, dengan tumpuan pada organ Corti dan fungsi selular nesprin-4.

Dapat dilihat bahawa penggunaan terapi gen untuk mencapai tujuan merawat penyakit keturunan di peringkat gen dengan memasukkan, membuang atau membetulkan sebarang gen yang bermutasi untuk rawatan (iaitu mengawal perubahan genetik dalam penyakit) mempunyai kesan klinikal yang tinggi.prospek permohonan.Kaedah terapi gen semasa untuk pekak kekurangan genetik boleh dibahagikan kepada kategori berikut:

penggantian gen

Penggantian gen boleh dikatakan sebagai bentuk terapi gen yang paling "terus terang", berdasarkan mengenal pasti dan menggantikan gen yang rosak dengan salinan gen yang normal atau liar.Kajian terapi gen telinga dalam pertama yang berjaya untuk kehilangan pendengaran yang disebabkan oleh pemadaman gen pengangkut glutamat vesikular 3 (VGLUT3);Penyampaian pengantaraan AAV1 bagi ekspresi berlebihan VGLUT3 eksogen dalam sel rambut telinga dalam (IHCs) Boleh mengakibatkan pemulihan pendengaran yang berterusan, pemulihan morfologi sinaptik reben separa dan tindak balas sawan [4].Walau bagaimanapun, dalam contoh termasuk dua penggantian gen yang dihantar oleh AAV yang diterangkan dalam pengenalan di atas, adalah penting untuk ambil perhatian bahawa model tetikus yang digunakan untuk jenis gangguan kehilangan pendengaran keturunan penghapusan gen tertentu adalah berbeza secara sementara daripada manusia, dan dalam tikus P1 , telinga dalam berada dalam peringkat perkembangan matang.Sebaliknya, manusia dilahirkan dengan telinga dalam yang matang.Perbezaan ini menghalang kemungkinan penggunaan hasil tetikus untuk rawatan gangguan pekak keturunan manusia melainkan terapi gen dihantar ke telinga tetikus matang.

Penyuntingan Gen: CRISPR/Cas9

Berbanding dengan "penggantian gen", perkembangan teknologi penyuntingan gen telah membawa fajar merawat penyakit genetik dari akar.Yang penting, kaedah penyuntingan gen menebus kelemahan kaedah terapi gen ekspresi berlebihan tradisional yang tidak sesuai untuk penyakit pekak keturunan yang dominan, dan masalah bahawa kaedah ekspresi berlebihan tidak bertahan lama.Selepas penyelidik China secara khusus menumpaskan alel mutan Myo6C442Y dalam tikus Myo6WT/C442Y menggunakan sistem penyuntingan gen AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, dan dalam tempoh 5 bulan kalah mati, tikus Fungsi pendengaran model telah dipulihkan;pada masa yang sama, ia juga diperhatikan bahawa kadar kelangsungan hidup sel rambut di telinga dalam telah bertambah baik, bentuk silia menjadi teratur, dan penunjuk elektrofisiologi telah diperbetulkan [5].Ini adalah kajian pertama di dunia yang menggunakan teknologi CRISPR/Cas9 untuk rawatan pekak keturunan yang disebabkan oleh mutasi gen Myo6, dan ia merupakan kemajuan penyelidikan penting teknologi penyuntingan gen untuk rawatan pekak keturunan.Terjemahan klinikal rawatan menyediakan asas saintifik yang kukuh.

Kaedah penyampaian terapi gen

Agar terapi gen berjaya, molekul DNA telanjang tidak dapat menembusi sel dengan berkesan kerana hidrofilik dan cas negatif kumpulan fosfat, dan untuk memastikan integriti molekul asid nukleik yang ditambah, kaedah yang selamat dan berkesan mesti dipilih.DNA yang ditambah dihantar ke sel atau tisu sasaran.AAV digunakan secara meluas sebagai kenderaan penghantaran untuk rawatan penyakit kerana kesan berjangkit yang tinggi, imunogenisiti rendah, dan tropisme yang luas kepada pelbagai jenis tisu.Pada masa ini, sekumpulan besar kerja penyelidikan telah menentukan tropisme subtipe AAV yang berbeza berbanding jenis sel yang berbeza dalam koklea tetikus.Menggunakan ciri penghantaran AAV digabungkan dengan promoter khusus sel boleh mencapai ekspresi khusus sel, yang boleh mengurangkan kesan luar sasaran.Di samping itu, sebagai alternatif kepada vektor AAV tradisional, vektor AAV sintetik baharu sentiasa dibangunkan dan menunjukkan keupayaan transduksi unggul di telinga dalam, yang mana AAV2/Anc80L65 adalah yang paling banyak digunakan.Kaedah penghantaran bukan virus boleh dibahagikan lagi kepada kaedah fizikal (microinjection dan electroporation) dan kaedah kimia (berasaskan lipid, berasaskan polimer, dan nanozarah emas).Kedua-dua pendekatan telah digunakan dalam rawatan gangguan pekak keturunan dan telah menunjukkan kelebihan dan batasan yang berbeza.Sebagai tambahan kepada kenderaan penghantaran untuk terapi gen sebagai kenderaan, pendekatan berbeza untuk pentadbiran gen in vivo boleh digunakan berdasarkan jenis sel sasaran yang berbeza, laluan pentadbiran dan keberkesanan terapeutik.Struktur rumit telinga dalam menjadikannya sukar untuk mencapai sel sasaran dan pengedaran agen penyunting genom adalah perlahan.Labirin membran terletak di dalam labirin tulang tulang temporal dan termasuk saluran koklea, saluran separuh bulatan, utrikel dan belon.Pengasingan relatifnya, peredaran limfa yang minimum, dan pemisahan daripada darah oleh penghalang labirin darah mengehadkan penghantaran sistemik yang berkesan terapeutik kepada tikus neonatal sahaja.Untuk mendapatkan titer virus yang sesuai untuk terapi gen, suntikan tempatan langsung vektor virus ke dalam telinga dalam adalah perlu.Laluan suntikan yang ditetapkan termasuk [6]: (1) membran tingkap bulat (RWM), (2) trakeostomi, (3) kokleostomi endolimfatik atau perilimfatik, (4) membran tingkap bulat ditambah fenestrasi tiub (CF) (seperti dalam Rajah 3).

Rajah 3.Penghantaran telinga dalam terapi gen.

Walaupun banyak kemajuan telah dibuat dalam terapi gen, berdasarkan matlamat translasi klinikal, lebih banyak kerja perlu dilakukan sebelum terapi gen boleh menjadi pilihan rawatan barisan pertama untuk pesakit yang mempunyai penyakit genetik, terutamanya dalam pembangunan vektor dan kaedah penghantaran yang selamat dan berkesan.Tetapi kami percaya bahawa dalam masa terdekat, jenis rawatan ini akan menjadi ruji terapi yang diperibadikan dan akan memberi kesan positif yang besar kepada kehidupan orang yang mengalami gangguan genetik dan keluarga mereka.

Foregene juga telah melancarkan kit saringan berdaya tinggi untuk gen yang disasarkan, yang pantas dan boleh melakukan transkripsi terbalik dan tindak balas qPCR tanpa pengekstrakan RNA.

Pautan Produk

Kit RT-qPCR Langsung Sel—Taqman/SYBR HIJAU I

Untuk maklumat lanjut produk, sila hubungi:

overseas@foregene.com