Nilai Ct ialah bentuk persembahan hasil yang paling penting bagi PCR kuantitatif pendarfluor.Ia digunakan untuk mengira perbezaan ekspresi gen atau nombor salinan gen.Jadi apakah nilai Ct kuantifikasi pendarfluor yang dianggap munasabah?Bagaimana untuk memastikan julat berkesan nilai Ct?
Apakah Nilai Ct?
Semasa proses penguatan qPCR, bilangan kitaran penguatan yang sepadan (Ambang Kitaran) apabila isyarat pendarfluor produk yang dikuatkan mencapai ambang pendarfluor yang ditetapkan.C bermaksud Cycle dan T bermaksud Threshold.Ringkasnya, nilai Ct ialah bilangan kitaran yang sepadan dengan apabila amplifikasi templat awal mencapai jumlah produk tertentu dalam qPCR.Apa yang dipanggil "jumlah produk tertentu" akan dijelaskan kemudian.
Apakah yang dilakukan oleh nilai Ct?
1. Hubungan antara penguatan eksponen, jumlah templat dan nilai Ct
Sebaik-baiknya, gen dalam qPCR terkumpul melalui penguatan eksponen selepas beberapa kitaran tertentu.Hubungan antara bilangan kitaran amplifikasi dan jumlah produk ialah: Jumlah produk diperkuat = jumlah templat awal × (1+En) nombor kitaran.Walau bagaimanapun, tindak balas qPCR tidak selalu dalam keadaan yang ideal.Apabila jumlah produk yang dikuatkan mencapai "jumlah produk tertentu", bilangan kitaran pada masa ini ialah nilai Ct, dan ia berada dalam tempoh penguatan eksponen.Hubungan antara nilai Ct dan jumlah templat permulaan: Terdapat hubungan linear antara nilai Ct templat dan logaritma nombor salinan permulaan templat.Semakin tinggi kepekatan templat awal, semakin kecil nilai Ct;semakin rendah kepekatan templat awal, semakin besar nilai Ct.
2.Keluk amplifikasi, ambang pendarfluor dan jumlah produk PCR tertentu
Jumlah produk penguatan qPCR dipersembahkan secara langsung dalam bentuk isyarat pendarfluor, iaitu lengkung penguatan.Pada peringkat awal PCR, penguatan berada di bawah keadaan ideal, bilangan kitaran kecil, pengumpulan produk adalah kecil, dan tahap pendarfluor tidak dapat dibezakan dengan jelas daripada latar belakang pendarfluor.Selepas itu, pendarfluor meningkat dan memasuki fasa eksponen.Jumlah produk PCR boleh dikesan pada titik tertentu apabila tindak balas PCR hanya dalam fasa eksponen, yang boleh digunakan sebagai "jumlah produk tertentu", dan kandungan awal templat boleh disimpulkan daripada ini.Oleh itu, keamatan isyarat pendarfluor sepadan dengan jumlah produk tertentu ialah ambang pendarfluor.
Pada peringkat akhir PCR, lengkung amplifikasi tidak lagi menunjukkan penguatan eksponen, dan memasuki fasa linear dan fasa dataran tinggi.
3. Kebolehulangan nilai Ct
Apabila kitaran PCR mencapai nombor kitaran nilai Ct, ia baru sahaja memasuki tempoh penguatan eksponen sebenar.Pada masa ini, ralat kecil belum dikuatkan, jadi kebolehulangan nilai Ct adalah sangat baik, iaitu, templat yang sama dikuatkan pada masa yang berbeza atau dalam tiub yang berbeza pada masa yang sama.Penguatan, nilai Ct yang diperoleh adalah malar.
1.Kecekapan penguatan En
Kecekapan amplifikasi PCR merujuk kepada kecekapan polimerase menukar gen untuk dikuatkan menjadi amplikon.Kecekapan amplifikasi apabila satu molekul DNA diubah menjadi dua molekul DNA ialah 100%.Kecekapan amplifikasi biasanya dinyatakan sebagai En.Untuk memudahkan analisis artikel seterusnya, faktor yang mempengaruhi kecekapan amplifikasi diperkenalkan secara ringkas.
| Faktor yang mempengaruhi | penerangan | Bagaimana untuk menilai? |
| A. perencat PCR | 1. DNA templat mengandungi bahan yang menghalang tindak balas PCR, seperti protein atau detergen.2. CDNA selepas transkripsi terbalik mengandungi kepekatan tinggi RNA templat atau komponen reagen RT, yang mungkin juga menghalang tindak balas PCR berikutnya. | 1. Sama ada terdapat pencemaran boleh dinilai dengan mengukur nisbah A260/A280 dan A260/A230 atau elektroforesis RNA.2. Sama ada cDNA dicairkan mengikut nisbah tertentu selepas transkripsi terbalik. |
| B. Reka bentuk primer yang tidak betul | Primer tidak menyepuh dengan cekap | Periksa primer untuk primer-dimer atau penyepit rambut, ketidakpadanan dan kadangkala merangkumi reka bentuk intronik. |
| C. Reka bentuk program tindak balas PCR yang tidak betul | 1. Primer tidak boleh disepuh dengan berkesan2. Pembebasan polimerase DNA yang tidak mencukupi 3. Aktiviti polimerase DNA suhu tinggi jangka panjang menurun | 1. Suhu penyepuhlindapan adalah lebih tinggi daripada nilai TM primer2. Masa pra-denaturasi terlalu singkat 3. Masa setiap peringkat prosedur tindak balas adalah terlalu lama |
| D. Pencampuran reagen atau kesilapan pemipetan yang tidak mencukupi | Dalam sistem tindak balas, kepekatan tempatan komponen tindak balas PCR terlalu tinggi atau tidak sekata, mengakibatkan penguatan bukan eksponen penguatan PCR | |
| E. Panjang Amplikon | Panjang amplikon terlalu panjang, melebihi 300bp, dan kecekapan amplifikasi adalah rendah | Semak sama ada panjang amplikon adalah antara 80-300bp |
| F. Pengaruh reagen qPCR | Kepekatan polimerase DNA dalam reagen adalah rendah atau kepekatan ion dalam penampan tidak dioptimumkan, menyebabkan aktiviti enzim Taq tidak mencapai maksimum. | Penentuan kecekapan amplifikasi mengikut lengkung piawai |
2.Julat nilai Ct
Nilai Ct berjulat antara 15-35.Jika nilai Ct kurang daripada 15, ia dianggap bahawa amplifikasi berada dalam julat tempoh garis dasar dan ambang pendarfluor belum dicapai.Sebaik-baiknya, terdapat hubungan linear antara nilai Ct dan logaritma nombor salinan awal templat, iaitu lengkung piawai.Melalui lengkung standard, apabila kecekapan amplifikasi adalah 100%, nilai Ct yang dikira untuk mengukur nombor salinan tunggal gen adalah sekitar 35. Jika lebih besar daripada 35, nombor salinan awal templat secara teorinya kurang daripada 1, yang boleh dianggap tidak bermakna.
Untuk julat Ct gen yang berbeza, disebabkan perbezaan dalam nombor salinan gen dan kecekapan amplifikasi dalam jumlah templat awal, adalah perlu untuk membuat lengkung standard untuk gen dan mengira julat pengesanan linear gen.
3. Faktor yang mempengaruhi nilai Ct
Daripada hubungan antara bilangan kitaran penguatan dan jumlah produk: jumlah produk yang dikuatkan = jumlah templat awal × (1+En) nombor kitaran, dapat dilihat bahawa dalam keadaan ideal, jumlah templat awal dan En akan memberi kesan negatif terhadap nilai Ct terjejas.Perbezaan dalam kualiti templat atau kecekapan amplifikasi akan menyebabkan nilai Ct menjadi terlalu besar atau terlalu kecil.
4. Nilai Ct terlalu besar atau terlalu kecil
Masa siaran: Feb-22-2023
