PCR Masa Nyata, juga dikenali sebagai PCR kuantitatif atau qPCR, ialah kaedah untuk pemantauan masa nyata dan analisis produk penguatan PCR.
Oleh kerana PCR kuantitatif mempunyai kelebihan operasi mudah, cepat dan mudah, sensitiviti tinggi, kebolehulangan yang baik, dan kadar pencemaran yang rendah, ia digunakan secara meluas dalam ujian perubatan, penilaian keberkesanan ubat, penyelidikan ekspresi gen, penyelidikan transgenik, pengesanan gen, pengesanan patogen, pengesanan haiwan dan tumbuhan., ujian makanan dan bidang lain.
Oleh itu, sama ada anda terlibat dalam penyelidikan asas dalam sains hayat, atau pekerja syarikat farmaseutikal, syarikat penternakan haiwan, syarikat makanan, atau pekerja biro pemeriksaan keluar masuk dan kuarantin, jabatan pemantauan alam sekitar, hospital dan unit lain, anda akan lebih kurang terdedah kepada Atau anda perlu mengetahui pengetahuan menguasai PCR kuantitatif.

Prinsip PCR Masa Nyata

PCR Masa Nyata ialah kaedah di mana bahan pendarfluor ditambah kepada sistem tindak balas PCR, dan keamatan isyarat pendarfluor dalam proses tindak balas PCR dipantau dalam masa nyata oleh instrumen PCR kuantitatif, dan akhirnya data eksperimen dianalisis dan diproses.

【Keluk penguatan】ialah lengkung yang menerangkan proses dinamik PCR.Lengkung amplifikasi PCR sebenarnya bukan lengkung eksponen piawai, tetapi lengkung sigmoid.

[Fasa platform lengkung amplifikasi]Dengan pertambahan bilangan kitaran PCR, penyahaktifan polimerase DNA, pengurangan dNTP dan primer, dan perencatan tindak balas sintesis oleh pirofosfat hasil sampingan tindak balas, dsb., PCR tidak sentiasa berkembang secara eksponen., dan akhirnya akan memasuki dataran tinggi.

[Keluk Penguatan Wilayah Pertumbuhan Eksponen]Walaupun fasa dataran tinggi berbeza-beza, di kawasan tertentu kawasan pertumbuhan eksponen lengkung amplifikasi, kebolehulangan adalah sangat baik, yang sangat penting untuk analisis kuantitatif PCR.

[Nilai ambang dan nilai Ct]Kami menetapkan nilai had pengesanan pendarfluor pada kedudukan yang sesuai dalam kawasan pertumbuhan eksponen lengkung amplifikasi, iaitu nilai ambang (Threshold).Persilangan nilai ambang dan lengkung amplifikasi ialah nilai Ct, iaitu nilai Ct merujuk kepada bilangan kitaran (Kitaran Ambang) apabila nilai ambang dicapai.

Graf di bawah jelas menunjukkan hubungan antara garis ambang dan lengkung amplifikasi, ambang dan nilai Ct.

【Bagaimana untuk mengukur?】

Telah dibuktikan oleh teori matematik bahawa nilai Ct mempunyai hubungan linear songsang dengan logaritma bilangan templat awal.PCR Masa Nyata memantau produk penguatan PCR dalam masa nyata dan mengukurnya semasa fasa penguatan eksponen.

Untuk setiap kitaran PCR, DNA meningkat secara eksponen sebanyak 2 kali ganda, dan tidak lama kemudian mencapai dataran tinggi.

Dengan mengandaikan bahawa jumlah DNA permulaan ialah A₀ , selepas n kitaran, jumlah teori produk DNA boleh dinyatakan sebagai:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Kemudian, lebih banyak jumlah DNA awal A 0, lebih cepat jumlah produk yang dikuatkan mencapai nilai pengesanan An , dan bilangan kitaran apabila mencapai An ialah nilai Ct.Iaitu, lebih banyak jumlah DNA awal A 0 adalah, lebih awal lengkung amplifikasi memuncak, dan sejajar dengan itu bilangan kitaran n yang diperlukan adalah lebih kecil.

Kami menjalankan pencairan kecerunan piawai kepekatan yang diketahui dan menggunakannya sebagai templat untuk PCR Masa Nyata, dan satu siri lengkung amplifikasi akan diperoleh pada selang masa yang sama dalam susunan permulaan jumlah DNA daripada lebih kepada kurang.Mengikut hubungan linear antara nilai Ct dan logaritma bilangan templat permulaan, a[lengkung piawai] boleh dibuat .

Dengan menggantikan nilai Ct sampel dengan kepekatan yang tidak diketahui ke dalam lengkung piawai, jumlah templat awal sampel dengan kepekatan yang tidak diketahui boleh diperolehi, iaitu prinsip kuantitatif PCR Masa Nyata.

Kaedah pengesanan PCR Masa Nyata

PCR Masa Nyata mengesan produk penguatan PCR dengan mengesan keamatan pendarfluor dalam sistem tindak balas.

Prinsip Kaedah Penyematan Pewarna Pendarfluor】

pewarna pendarfluor, seperti TB Green ® , boleh mengikat secara tidak spesifik kepada DNA untai dua dalam sistem PCR dan berpendar apabila diikat.

Keamatan pendarfluor dalam sistem tindak balas meningkat secara eksponen dengan peningkatan kitaran PCR.Dengan mengesan keamatan pendarfluor, jumlah penguatan DNA dalam sistem tindak balas boleh dipantau dalam masa nyata, dan kemudian jumlah templat permulaan dalam sampel boleh dianggarkan secara terbalik.

【Prinsip kaedah kuar pendarfluor】

kuar pendarfluorialah jujukan asid nukleik dengan kumpulan pendarfluor pada hujung 5′ dan kumpulan pelindapkejutan pada hujung 3′, yang secara khusus boleh mengikat templat.Apabila probe utuh, pendarfluor yang dipancarkan oleh fluorophore dipadamkan oleh kumpulan pelindapkejutan dan tidak boleh pendarfluor.Apabila probe terurai, bahan pendarfluor akan tercerai dan mengeluarkan pendarfluor.

Siasatan pendarfluor ditambah kepada larutan tindak balas PCR.Semasa proses penyepuhlindapan, probe pendarfluor akan terikat pada kedudukan khusus templat.Semasa proses lanjutan, aktiviti eksonuklease 5′→3′ enzim PCR boleh menguraikan probe pendarfluor yang dihibridkan dengan templat, dan bahan pendarfluor diasingkan untuk mengeluarkan pendarfluor.Dengan mengesan keamatan pendarfluor probe dalam sistem tindak balas, tujuan memantau jumlah penguatan produk PCR boleh dicapai.

【Pemilihan Kaedah Pengesanan Pendarfluor】

Jika ia digunakan untuk membezakan jujukan dengan homologi tinggi dan melakukan pengesanan PCR multipleks seperti analisis menaip SNP, kaedah probe pendarfluor tidak boleh diganti.
Untuk eksperimen PCR Masa Nyata yang lain, kaedah chimera pendarfluor yang mudah, mudah dan kos rendah boleh digunakan.

probesKekhususan yang kuat, berkeupayaan untuk PCR multipleks

Kelemahan

Keperluan kekhususan tinggi untuk amplifikasi;

PCR multipleks tidak boleh dilakukanPerlu mereka bentuk probe khusus, kos tinggi;

kadang-kadang reka bentuk kuar adalah sukar

Produk Berkaitan: