PCR, pelbagai PCR, PCR di situ, PCR terbalik, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Kami akan menyusun konsep, langkah dan butiran pelbagai PCR

Ⅰ. PCR

Tindak balas Rantaian Polimerase, dirujuk sebagai PCR, ialah teknologi biologi molekul yang digunakan untuk membesarkan serpihan DNA tertentu.Ia boleh dianggap sebagai replikasi DNA khas secara in vitro.DNA polimerase (DNA Polymerase I) ditemui seawal tahun 1955, dan Fragmen Klenow E. Coli, yang mempunyai nilai eksperimen dan kepraktisan, ditemui oleh Dr. H. Klenow pada awal 1970-an, tetapi kerana enzim ini tidak bertolak ansur dengan suhu, suhu tinggi boleh merosot, jadi ia tidak memenuhi tindak balas rantai polimerase yang tinggi.Enzim yang digunakan hari ini (dipanggil Taq polymerase), telah diasingkan daripada Thermus aquaticus, bakteria mata air panas pada tahun 1976. Ciri-cirinya ialah ia boleh menahan suhu tinggi dan merupakan enzim yang ideal, tetapi ia digunakan secara meluas selepas 1980-an.Konsep asal prototaip primitif asal PCR adalah serupa dengan pembaikan dan penyalinan gen, yang dicadangkan oleh Dr. KJell Kleppe pada tahun 1971. Beliau menerbitkan salinan gen mudah dan jangka pendek pertama (sama dengan dua tindak balas kitaran pertama PCR).PCR yang dibangunkan hari ini telah dibangunkan oleh Dr. Kary B. Mullis pada tahun 1983. Dr. Mullis berkhidmat kepada syarikat PE pada tahun itu, jadi PE mempunyai status istimewa dalam industri PCR.Dr. Mullis secara rasmi menerbitkan kertas berkaitan pertama dengan Saiki dan lain-lain pada tahun 1985. Sejak itu, penggunaan PCR adalah beribu-ribu batu sehari, dan kualiti kertas berkaitan boleh dikatakan menyebabkan banyak kaedah penyelidikan lain tidak menyenangkan.Selepas itu, teknologi PCR digunakan secara meluas dalam penyelidikan saintifik biologi dan aplikasi klinikal, menjadi teknologi terpenting dalam penyelidikan biologi molekul.Mullis juga memenangi Hadiah Nobel dalam Kimia 1993.

PCRPrinsip

Prinsip asas teknologi PCR adalah serupa dengan proses replikasi semula jadi DNA, dan kekhususannya bergantung pada primer oligonukleotida yang merupakan pelengkap kepada kedua-dua hujung jujukan sasaran.PCR terdiri daripada tiga langkah tindak balas asas degenerasi penyepuhlindapan: ①Degenerasi DNA templat: Selepas DNA templat dipanaskan kepada kira-kira 93°C untuk tempoh masa tertentu, penyelesaian dwi DNA untuk DNA dwi-rantaian dibentuk oleh penguatan PCR DNA templat Meninggalkan, jadikan ia satu rantaian supaya ia boleh digabungkan dengan tindak balas bulat seterusnya untuk digabungkan dengan tindak balas bulat seterusnya.②Penyepuhlindapan (sebatian) DNA templat dan primer: Selepas DNA templat dipanaskan dan merosot menjadi rantai tunggal, suhu turun kepada kira-kira 55°C.Urutan pelengkap primer dan rantai tunggal DNA templat.③Pelanjutan primer: Templat DNA-pengikatan primer adalah berdasarkan tindakan polimerase TaqDNA, dengan dNTP sebagai bahan mentah tindak balas.Mengekalkan prinsip replikasi, mensintesis rantai salinan separuh simpanan baharu yang melengkapkan rantai DNA templat, dan kitaran ulangan degenerasi-pelanjutan penyepuhlindapan tiga proses boleh mendapatkan lebih banyak "rantaian salinan separuh simpanan", dan rantai baharu ini tersedia semula Menjadi templat untuk kitaran seterusnya.Ia mengambil masa 2-4min untuk melengkapkan gelung, gen sasaran boleh dikuatkan beberapa juta kali dalam 2-3 jam.

StandardPCRSistem Tindak Balas

Lima unsur tindak balas PCR

Terdapat lima jenis bahan yang terlibat dalam tindak balas PCR, iaitu primer, enzim, dNTP, templat dan penimbal (Mg2+ diperlukan).[prosedur PCR]

Proses PCR standard dibahagikan kepada tiga langkah

1. Kemerosotan DNA (90°C-96°C): Templat DNA rantaian dwi di bawah tindakan haba, ikatan hidrogen pecah, membentuk DNA rantaian tunggal.

2. Penyepuhlindapan (25℃ -65℃): Suhu sistem dikurangkan, primer digabungkan dengan templat DNA untuk membentuk dwi-rantai tempatan.

3. Sambungan (70℃ -75℃): Di bawah tindakan enzim Taq (kira-kira 72°C, aktiviti terbaik), dNTP digunakan sebagai bahan mentah, memanjang dari hujung 5′ primer → hujung 3′, sintesis dan templat saling melengkapi rantai DNA.

Setiap kitaran didenaturasi, disepuhlindap dan dilanjutkan, menggandakan kandungan DNA.Pada masa ini, disebabkan kawasan amplifikasi yang pendek, sesetengah PCR boleh direplikasi dalam masa yang sangat singkat walaupun aktiviti enzim Taq tidak optimum, jadi ia boleh ditukar kepada dua langkah, iaitu, penyepuhlindapan dan lanjutan boleh dilakukan pada 60°C-65°C pada masa yang sama.Untuk mengurangkan proses mengangkat dan menyejukkan dan meningkatkan kelajuan tindak balas.

Ciri-ciri Reaksi PCR

● Kekhususan Tinggi

Faktor penentu khusus tindak balas PCR ialah: ①Gabungan khusus primer dan DNA templat.②Prinsip pasangan asas.③Kesetiaan tindak balas sintesis polimerase TaqDNA.④Kekhususan dan konservatif gen sasaran.

Gabungan primer dan templat yang betul adalah kuncinya.Pengikatan primer dan templat dan lanjutan rantai primer adalah berdasarkan prinsip padanan asas alkali.Kesetiaan tindak balas sintesis polimerase dan rintangan suhu tinggi polimerase DNA Taq untuk menjadikan pengikatan (kompaun) templat dan primer dalam tindak balas boleh dilakukan pada suhu yang lebih tinggi.Kekhususan gabungan sangat meningkat.Klip boleh mengekalkan tahap ketepatan yang tinggi.Dengan memilih kawasan genetik sasaran dengan konservatif tinggi dan konservatif tinggi, kekhususannya lebih tinggi.

● Kepekaan Tinggi

Jumlah pengeluaran produk PCR meningkat mengikut indeks, yang boleh mengembangkan templat permulaan Picker (PG=10-12) untuk meningkatkan tahap mikropengawal ke tahap mikrogram (μg= -6).Sel sasaran boleh dikesan daripada 1 juta sel;dalam pengesanan virus, sensitiviti PCR boleh mencapai 3 RFU (titik kosong yang terbentuk unit);kadar pengesanan minimum dalam sains bakteria ialah 3 bakteria.

● Mudah dan Pantas

Pantulan PCR menggunakan polimerase DNA Taq suhu tinggi, yang menambah penyelesaian tindak balas pada satu masa, iaitu tindak balas degenerasi-annea-sambungan pada larutan amplifikasi DNA dan periuk mandi air.Secara amnya, tindak balas penguatan selesai dalam 2 hingga 4 jam.Produk tambahan biasanya dianalisis dengan pedang elektrik, dan tidak perlu menggunakan isotop, tiada pencemaran radioaktif, dan promosi yang mudah.

● Ketulenan spesimen adalah rendah

Tidak perlu memisahkan virus atau bakteria dan sel kultur.Produk mentah DNA dan RNA boleh digunakan sebagai penguat.Pengesanan amplifikasi DNA boleh digunakan secara langsung menggunakan spesimen klinikal seperti darah, cecair badan, cecair pencuci batuk, rambut, sel dan tisu hidup.

PCRmasalah biasa

● Negatif palsu, tiada jalur yang dikuatkan

Peringkat utama tindak balas PCR termasuk: ① penyediaan asid nukleik templat, ② kualiti dan kekhususan primer, ③ kualiti enzim ④ keadaan kitaran PCR.Mencari sebab juga perlu dianalisis dan dikaji untuk pautan di atas.

Templat: ① Templat mengandungi pelbagai protein, ② Templat mengandungi perencat enzim Taq, ③ Protein dalam templat tidak disingkirkan, terutamanya protein kumpulan dalam kromosom.⑤ Degenerasi asid nukleik deminer tidak menyeluruh.Apabila kualiti enzim dan primer adalah baik, tiada jalur amplifikasi, yang kemungkinan besar adalah rawatan pencernaan spesimen.Terdapat sesuatu yang tidak kena dengan proses pengekstrakan asid nukleik templat, jadi untuk menyediakan penyelesaian pencernaan yang berkesan dan stabil, prosedurnya harus diperbaiki dan tidak diubah sewenang-wenangnya.

Penyahaktifan enzim: enzim baharu atau kedua-dua enzim lama dan baharu harus digunakan bersama untuk menganalisis sama ada aktiviti enzim hilang atau tidak mencukupi, yang membawa kepada negatif palsu.Perlu diingatkan bahawa enzim Taq atau etidium bromida kadang-kadang dilupakan.

Primer: kualiti primer, kepekatan primer, dan sama ada kepekatan dua primer adalah simetri.Ia adalah sebab biasa kegagalan PCR atau jalur yang semakin meningkat tidak sesuai dan terdedah kepada meresap.Terdapat masalah dengan kualiti buku asas beberapa nombor kelompok.Kedua-dua primer mempunyai kepekatan tinggi dan kepekatan rendah, menyebabkan penguatan asimetri kecekapan rendah.Tindakan balas adalah: ① Pilih buku asas yang baik untuk mensintesis unit.② Kepekatan primer bukan sahaja bergantung pada nilai OD, tetapi juga memberi perhatian kepada cecair asal primer untuk membuat elektroforesis gel gula agar.Mesti ada zon jalur primer, dan kecerahan kedua-dua primer hendaklah konsisten secara umumnya.Tali pinggang, PCR mungkin gagal pada masa ini, dan ia harus diselesaikan dengan unit sintesis primer.Jika primer adalah tinggi, kecerahannya rendah, dan kepekatannya mesti seimbang apabila dicairkan.③ Primer hendaklah dibayar dan disimpan pada kepekatan yang tinggi untuk mengelakkan beberapa pembekuan atau bahagian penyejukan jangka panjang peti sejuk, yang akan menyebabkan primer merosot dan merosot.④ Reka bentuk primer tidak munasabah, seperti panjang primer tidak mencukupi, dan gugusan di terbentuk di antara primer.

Kepekatan Mg2+: Kepekatan ion Mg2+ mempunyai kesan yang besar terhadap kecekapan penguatan PCR.Kepekatan yang berlebihan boleh mengurangkan jantina yang bertentangan dengan amplifikasi PCR.Jika kepekatan terlalu rendah, output amplifikasi PCR akan menyebabkan kegagalan amplifikasi PCR tanpa jalur pengembangan.

Perubahan isipadu tindak balas: Isipadu yang digunakan dalam penguatan PCR ialah 20ul, 30ul, dan 50ul atau 100uL, volum besar permohonan untuk penguatan PCR ditetapkan mengikut tujuan penyelidikan saintifik dan ujian klinikal yang berbeza.Selepas membuat volum kecil seperti 20ul, perlu membuat keadaan kord semasa membuat saiz, jika tidak, ia akan gagal.

Sebab fizikal: Transformasi sangat penting untuk penguatan PCR.Jika suhu degenerasi rendah, masa degenerasi adalah pendek, ia mungkin berlaku dalam negatif palsu;suhu penyepuhlindapan yang terlalu rendah boleh menyebabkan penguatan bukan khusus dan mengurangkan kecekapan penguatan khusus.Sangat mempengaruhi gabungan primer dan templat untuk mengurangkan kecekapan amplifikasi PCR.Kadangkala perlu menggunakan termometer standard untuk mengesan kebolehubahan, penyepuhlindapan dan suhu lanjutan dalam sambungan atau periuk larut air, yang merupakan salah satu sebab kegagalan PCR.

Varian jujukan sasaran: Jika jujukan sasaran berlaku, mutasi atau pemadaman, gabungan prototaip dan templat digabungkan, atau disebabkan kekurangan jujukan sasaran, primer dan templat akan kehilangan jujukan pelengkap, dan penguatan PCRnya tidak akan berjaya.

● Positif palsu

Jalur amplifikasi PCR kelihatan konsisten dengan jalur jujukan sasaran, dan kadangkala jalurnya lebih kemas dan lebih tinggi.

Reka bentuk primer tidak sesuai: urutan penguatan yang dipilih dan urutan penguatan bukan tujuan mempunyai homolog, jadi apabila penguatan PCR, produk PCR yang dikuatkan adalah urutan bukan bertujuan.Urutan sasaran terlalu pendek atau buku asas terlalu pendek, dan ia terdedah kepada positif palsu.Perlu direka bentuk semula.

Pencemaran silang jujukan sasaran atau produk penguatan: Terdapat dua sebab untuk pencemaran ini: Pertama, pencemaran silang keseluruhan genom atau segmen besar, yang membawa kepada positif palsu.Positif palsu jenis ini boleh diselesaikan dengan kaedah berikut: Berhati-hati dan lembut semasa operasi untuk mengelakkan urutan sasaran daripada disedut ke dalam pistol sampel atau percikan keluar dari tiub empar.Kecuali enzim dan bahan yang tidak dapat menahan suhu tinggi, semua reagen atau peralatan hendaklah dinyahjangkit dengan tekanan tinggi.Paip dan sampel empar hendaklah digunakan pada satu masa.Apabila perlu, sebelum menambah spesimen, tiub tindak balas dan reagen didedahkan kepada sinaran ultraungu untuk memusnahkan asid nukleik sedia ada.Kedua, serpihan kecil dalam pencemaran udara.Serpihan kecil ini lebih pendek daripada jujukan sasaran, tetapi ia mempunyai homologi tertentu.Ia boleh disambung antara satu sama lain.Selepas melengkapkan primer, produk PCR boleh dikembangkan, yang akan menyebabkan pengeluaran positif palsu.Ia boleh digunakan untuk mengurangkan atau menghapuskan kaedah PCR sarang.

● Muncul jalur penguatan tidak spesifik

Jalur yang muncul selepas amplifikasi PCR adalah tidak konsisten dengan saiz yang dijangkakan, atau besar atau kecil, atau pada masa yang sama, atau pada masa yang sama, jalur amplifikasi khusus dan jalur amplifikasi bukan khusus.Kemunculan jalur bukan khusus ialah: Pertama, primer tidak lengkap pelengkap kepada jujukan sasaran, atau pempolimeran primer untuk membentuk gugusan di.Yang kedua ialah kepekatan ion MG2+ terlalu tinggi, suhu penyepuhlindapan terlalu rendah, dan bilangan kitaran PCR adalah berkaitan.Kedua, kualiti dan jumlah enzim.Selalunya, enzim beberapa sumber terdedah kepada jalur bukan khas dan enzim sumber lain tidak berlaku.Kadangkala penguatan bukan spesifik enzim juga berlaku.Langkah-langkah balasnya ialah: reka bentuk semula yang menarik jika perlu.Kurangkan jumlah enzim atau gantikan enzim sumber lain.Kurangkan jumlah primer, tingkatkan jumlah templat dengan sewajarnya, dan kurangkan bilangan kitaran.Tingkatkan suhu penyepuhlindapan dengan betul atau gunakan kaedah dua titik suhu (degenerasi 93°C, penyepuhlindapan dan pemanjangan pada kira-kira 65°C).

● Kelihatan penarik berkelupas atau pita sapuan

Penguatan PCR kadangkala kelihatan digunakan atau dicengkerang atau tali pinggang seperti permaidani.Atas sebab itu, disebabkan oleh jumlah enzim yang berlebihan atau kualiti enzim yang rendah, kepekatan dNTP terlalu tinggi, kepekatan Mg2+ terlalu tinggi, suhu penyepuhlindapan terlalu rendah, dan bilangan kitaran terlalu banyak.Tindakan balas adalah: ①Kurangkan jumlah enzim, atau tukar enzim sumber lain.②Kurangkan kepekatan dNTP ③Kurangkan kepekatan Mg2+ dengan betul.④Tingkatkan kuantiti templat dan kurangkan bilangan kitaran.

Produk Berkaitan

PCR Heroᵀᴹ (Dengan Pewarna)

◮ Kesetiaan yang lebih tinggi: 6 kali ganda daripada enzim Taq biasa;

◮ Kelajuan amplifikasi yang lebih pantas

◮ Lebih banyak kebolehsuaian templat

◮ Kecekapan amplifikasi yang lebih tinggi

◮ Toleransi alam sekitar lebih kuat: diletakkan pada suhu 37°C selama seminggu, mengekalkan lebih daripada 90% aktiviti;

◮ Ia mempunyai aktiviti polimerase DNA 5'→3' dan aktiviti exonuclease 5'→3', tanpa aktiviti exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Dengan Pewarna)

Sistem tindak balas yang unik dan Taq DNA Polymerase berkecekapan tinggi menjadikan tindak balas PCR mempunyai kecekapan penguatan, kekhususan dan kepekaan yang lebih tinggi.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Satu Langkah)-SYBR Green I

◮ Kit satu langkah membuat transkripsi terbalik dan qPCR dua tindak balas dalam tiub yang sama, hanya perlu menambah RNA templat, primer PCR khusus dan ddH Bebas RNase₂O.

◮ Kit boleh menganalisis RNA virus atau mengesan RNA secara kuantitatif dengan cepat dan cekap.

◮ Kit ini menggunakan reagen transkripsi terbalik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungkan dengan sistem tindak balas yang unik untuk meningkatkan kecekapan amplifikasi dan kekhususan tindak balas dengan berkesan.

◮ Sistem tindak balas yang dioptimumkan menjadikan tindak balas mempunyai kepekaan pengesanan yang lebih tinggi, kestabilan haba yang lebih kuat dan toleransi yang lebih baik.

◮ RT-qPCR Mudah^TM(Satu Langkah)-Kit SYBR Green I dilengkapi dengan pewarna rujukan dalaman ROX, yang boleh digunakan untuk menghapuskan latar belakang isyarat dan ralat isyarat antara telaga, yang mudah digunakan oleh pelanggan dalam model instrumen PCR kuantitatif yang berbeza.

RT Mudah^TMII (Master Premix untuk sintesis cDNA untaian pertama untukPCR Masa Nyata)

-Keupayaan cekap untuk mengeluarkan gDNA, yang boleh mengeluarkan gDNA dalam templat dalam masa 2 minit.

-Sistem transkripsi terbalik yang cekap, hanya mengambil masa 15 minit untuk menyelesaikan sintesis cDNA untai pertama.

-Templat kompleks: templat dengan kandungan GC tinggi dan struktur sekunder yang kompleks juga boleh diterbalikkan dengan kecekapan tinggi.

-Sistem transkripsi songsang sensitiviti tinggi, templat peringkat pg juga boleh mendapatkan cDNA berkualiti tinggi.

-Sistem transkripsi terbalik mempunyai kestabilan terma yang tinggi, suhu tindak balas optimum ialah 42 ℃, dan ia masih mempunyai prestasi transkripsi terbalik yang baik pada 50 ℃.