PCR (tindak balas rantai polimerase) ialah salah satu daripada teknologi penguatan DNA in-vitro, dengan sejarah lebih daripada 30 tahun.

Teknologi PCR telah dipelopori oleh Kary Mullis dari Cetus, Amerika Syarikat pada tahun 1983. Mullis memohon paten PCR pada tahun 1985 dan menerbitkan kertas akademik PCR pertama mengenai Sains pada tahun yang sama.Mullis telah dianugerahkan Hadiah Nobel dalam bidang kimia pada tahun 1993 untuk kerjanya.

Prinsip Asas PCR

PCR boleh menguatkan serpihan DNA sasaran lebih daripada satu juta kali.Prinsipnya adalah di bawah pemangkinan DNA polimerase, menggunakan DNA untai induk sebagai templat dan primer khusus sebagai titik permulaan untuk lanjutan.Ia direplikasi secara in vitro melalui langkah-langkah seperti denaturasi, penyepuhlindapan, dan lanjutan.Proses DNA untai anak pelengkap kepada DNA templat untai induk.

Proses PCR standard dibahagikan kepada tiga langkah:

1. Denaturasi: Gunakan suhu tinggi untuk memisahkan helai ganda DNA.Ikatan hidrogen antara helai ganda DNA terputus pada suhu tinggi (93-98 ℃).

2. Penyepuhlindapan: Selepas DNA untai dua diasingkan, turunkan suhu supaya primer boleh mengikat DNA untai tunggal.

3.Pelanjutan: Polimerase DNA mula mensintesis helai pelengkap di sepanjang helai DNA daripada primer terikat apabila suhu diturunkan.Apabila sambungan selesai, satu kitaran selesai, dan bilangan serpihan DNA berganda

Mengulang tiga langkah ini 25-35 kali ganda, bilangan serpihan DNA akan meningkat secara eksponen.

Kepintaran PCR ialah primer yang berbeza boleh direka bentuk untuk gen sasaran yang berbeza, supaya serpihan gen sasaran boleh dikuatkan dalam tempoh yang singkat.

Setakat ini, PCR boleh dibahagikan kepada tiga kategori iaitu PCR biasa, PCR kuantitatif pendarfluor dan PCR digital.

Generasi pertama PCR biasa

Gunakan instrumen penguatan PCR biasa untuk menguatkan gen sasaran, dan kemudian gunakan elektroforesis gel agarose untuk mengesan produk, hanya analisis kualitatif boleh dilakukan.

Kelemahan utama PCR generasi pertama:

1.Terdedah kepada penguatan tidak khusus dan keputusan positif palsu.

2. Pengesanan mengambil masa yang lama dan operasinya menyusahkan.

3.Hanya ujian kualitatif boleh dilakukan

PCR Masa Nyata generasi kedua

PCR Masa Nyata, juga dikenali sebagai qPCR, menggunakan probe pendarfluor yang boleh menunjukkan kemajuan sistem tindak balas, dan memantau pengumpulan produk yang dikuatkan melalui pengumpulan isyarat pendarfluor, dan menilai keputusan melalui lengkung pendarfluor.Ia boleh dikira dengan bantuan nilai Cq dan keluk piawai.

Oleh kerana teknologi qPCR dijalankan dalam sistem tertutup, kebarangkalian pencemaran dikurangkan, dan isyarat pendarfluor boleh dipantau untuk pengesanan kuantitatif, jadi ia adalah yang paling banyak digunakan dalam amalan klinikal dan telah menjadi teknologi dominan dalam PCR.

Bahan pendarfluor yang digunakan dalam PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata boleh dibahagikan kepada: Kuar pendarfluor TaqMan, suar molekul dan pewarna pendarfluor.

1) Kuar pendarfluor TaqMan:

Semasa penguatan PCR, probe pendarfluor tertentu ditambah sambil menambah sepasang primer.Probe ialah oligonukleotida, dan kedua-dua hujungnya dilabelkan dengan kumpulan pendarfluor wartawan dan kumpulan pendarfluor pelindapkejut.

Apabila probe utuh, isyarat pendarfluor yang dipancarkan oleh kumpulan wartawan diserap oleh kumpulan pelindapkejutan;semasa penguatan PCR, aktiviti 5′-3′ exonuclease enzim Taq membelah dan merendahkan probe, menjadikan kumpulan pendarfluor reporter dan pelindapkejut Kumpulan pendarfluor diasingkan, supaya sistem pemantauan pendarfluor boleh menerima isyarat pendarfluor, iaitu, setiap kali untaian DNA dikuatkan sepenuhnya, membentuk isyarat pendarfluor tersusun, dan molekul pendarfluor terkumpul. produk PCR.

2) pewarna pendarfluor SYBR:

Dalam sistem tindak balas PCR, lebihan pewarna pendarfluor SYBR ditambah.Selepas pewarna pendarfluor SYBR tidak dimasukkan secara khusus ke dalam untaian dua DNA, ia mengeluarkan isyarat pendarfluor.Molekul pewarna SYBR yang tidak digabungkan ke dalam rantai tidak akan mengeluarkan sebarang isyarat pendarfluor, dengan itu memastikan isyarat pendarfluor Peningkatan dalam produk PCR disegerakkan sepenuhnya dengan peningkatan dalam produk PCR.SYBR hanya mengikat kepada DNA untai dua, jadi lengkung lebur boleh digunakan untuk menentukan sama ada tindak balas PCR adalah khusus.

3) Suar molekul:

Ia adalah probe oligonukleotida berlabel dua gelung batang yang membentuk struktur jepit rambut kira-kira 8 tapak pada 5 dan 3 hujungnya.Jujukan asid nukleik pada kedua-dua hujung berpasangan secara lengkap, menyebabkan kumpulan pendarfluor dan kumpulan pelindapkejutan menjadi ketat.Tutup, tiada pendarfluor akan dihasilkan.

Selepas produk PCR dijana, semasa proses penyepuhlindapan, bahagian tengah suar molekul dipasangkan dengan urutan DNA tertentu, dan gen pendarfluor dipisahkan daripada gen pelindapkejut untuk menghasilkan pendarfluor.

Kelemahan utama PCR generasi kedua:

Sensitiviti masih kurang, dan pengesanan spesimen salinan rendah adalah tidak tepat.

Terdapat pengaruh nilai latar belakang, dan hasilnya terdedah kepada gangguan.

Apabila terdapat perencat PCR dalam sistem tindak balas, hasil pengesanan terdedah kepada gangguan.

PCR digital generasi ketiga

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) mengira nombor salinan jujukan sasaran melalui pengesanan titik akhir, dan boleh melakukan pengesanan kuantitatif mutlak yang tepat tanpa menggunakan kawalan dalaman dan lengkung standard.

PCR digital menggunakan pengesanan titik akhir dan tidak bergantung pada nilai Ct (ambang kitaran), jadi tindak balas PCR digital kurang terjejas oleh kecekapan amplifikasi, dan toleransi terhadap perencat tindak balas PCR dipertingkatkan, dengan ketepatan dan kebolehulangan yang tinggi.

Disebabkan oleh ciri-ciri kepekaan yang tinggi dan ketepatan yang tinggi, ia tidak mudah diganggu oleh perencat tindak balas PCR, dan ia boleh mencapai kuantifikasi mutlak sebenar tanpa produk standard, yang telah menjadi hotspot penyelidikan dan aplikasi.

Mengikut bentuk unit tindak balas yang berbeza, ia boleh dibahagikan kepada tiga jenis utama: sistem mikrofluidik, cip dan titisan.

1) PCR digital mikrofluidik, mdPCR:

Berdasarkan teknologi mikrobendalir, templat DNA diasingkan.Teknologi mikrofluidik boleh merealisasikan sampel menaik taraf nano atau penjanaan titisan yang lebih kecil, tetapi titisan memerlukan kaedah penjerapan khas dan kemudian digabungkan dengan sistem tindak balas PCR.mdPCR secara beransur-ansur telah diterima pakai oleh kaedah lain menggantikan.

2) PCR digital berasaskan titisan, ddPCR:

Gunakan teknologi penjanaan titisan air dalam minyak untuk memproses sampel menjadi titisan, dan bahagikan sistem tindak balas yang mengandungi molekul asid nukleik kepada beribu-ribu titisan skala nano, setiap satunya tidak mengandungi molekul sasaran asid nukleik untuk dikesan, atau Mengandungi satu hingga beberapa molekul sasaran asid nukleik untuk diuji.

3) PCR digital berasaskan cip, cdPCR:

Gunakan teknologi laluan cecair bersepadu untuk mengukir banyak tiub mikro dan rongga mikro pada wafer silikon atau kaca kuarza, dan mengawal aliran larutan melalui injap kawalan yang berbeza, dan membahagikan cecair sampel kepada nanometer dengan saiz yang sama ke dalam telaga tindak balas untuk Tindak balas PCR digital untuk mencapai kuantiti mutlak.

Kelemahan utama PCR generasi ketiga:

Peralatan dan reagen adalah mahal.

Keperluan kualiti templat adalah tinggi.Jika kuantiti templat melebihi kuantiti mikrosistem, adalah mustahil untuk dikira, dan jika terlalu kecil, ketepatan pengiraan akan dikurangkan.

Positif palsu juga boleh dijana apabila terdapat penguatan bukan khusus.