COVID-19 ialah penyakit berjangkit yang disebabkan oleh Sindrom Pernafasan Akut Teruk Jenis Koronavirus 2. Apabila seseorang dijangkiti, gejala yang paling biasa termasuk demam, batuk dan sesak nafas.

Sampel yang digunakan untuk ujian boleh dikumpulkan dengan swab nasofaring atau swab orofarinks.

Apakah PCR?

Kaedah standard pengesanan coronavirus ialah tindak balas rantai polimerase, PCR.Ini adalah kaedah yang digunakan secara meluas dalam biologi molekul.Ia boleh menyalin berjuta-juta kepada berbilion-bilion serpihan DNA tertentu dengan cepat.

Koronavirus baharu mengandungi genom RNA untai tunggal yang sangat panjang.Untuk mengesan virus ini dengan PCR, molekul RNA mesti ditukar kepada urutan DNA pelengkapnya dengan transkripase terbalik, dan kemudian DNA yang baru disintesis boleh dikuatkan dengan prosedur PCR standard, yang biasanya dikenali sebagai RT-PCR.

Proses RT-PCR

Pengekstrakan RNA

Untuk melaksanakan kaedah ini, RNA virus pada asasnya harus diekstrak.Pelbagai kit penulenan RNA boleh digunakan untuk pemisahan yang mudah, cepat dan berkesan.

Untuk mengekstrak RNA virus menggunakan kit komersial, mula-mula masukkan sampel ke dalam tiub mikrosentrifuge dan kemudian campurkan dengan penimbal lisis.Penampan ini sangat denaturasi dan biasanya terdiri daripada fenol dan guanidine isothiocyanate.Di samping itu, perencat RNase biasanya terdapat dalam penimbal lisis untuk memastikan pengasingan RNA virus yang utuh.

Selepas menambah penimbal lisis, pusaran tiub pencampur dengan denyutan dan eramkan pada suhu bilik.Virus itu kemudiannya dilisiskan di bawah keadaan denaturasi tinggi yang disediakan oleh penimbal lisis.

Selepas sampel dilisiskan, tiub emparan digunakan untuk prosedur penulenan.Sampel dimasukkan ke dalam tiub emparan dan kemudian diempar.

Prosedur ini adalah kaedah pengekstrakan fasa pepejal di mana fasa pegun terdiri daripada matriks gel silika.

Di bawah keadaan garam dan pH yang optimum, molekul RNA mengikat membran silika.

Pada masa yang sama, protein dan bahan cemar lain dikeluarkan.

Selepas sentrifugasi, masukkan tiub emparan ke dalam tiub pengumpulan bersih, buang turasan, dan kemudian tambah penimbal basuh.

Letakkan tiub dalam emparan sekali lagi untuk memaksa penimbal basuh melalui membran.Ini akan membuang semua kekotoran yang tinggal dari membran, meninggalkan hanya RNA yang terikat pada gel silika.

Selepas sampel dicuci, masukkan tiub ke dalam tiub microcentrifuge yang bersih dan tambah penimbal elusi.

Ia kemudiannya disentrifugasi untuk memaksa penimbal elusi melalui membran.Penampan elusi membuang RNA virus daripada lajur putaran dan memperoleh RNA yang telah dimurnikan tanpa protein, perencat dan bahan cemar lain.

LANGKAH 2

Campuran pekat

Selepas mengekstrak RNA virus, langkah seterusnya ialah menyediakan campuran tindak balas untuk penguatan PCR.Dalam langkah ini, pekat digunakan.Larutan pekat ini ialah larutan pekat pracampuran yang terdiri daripada pracampuran, transkripase terbalik, nukleotida, primer hadapan, primer terbalik, probe TaqMan dan polimerase DNA.

Akhirnya, untuk melengkapkan campuran tindak balas ini, templat RNA ditambah.Tiub dicampur dengan pusaran nadi, dan kemudian campuran tindak balas dimuatkan ke dalam plat PCR.Plat PCR biasanya mengandungi 96 telaga dan boleh menganalisis berbilang sampel pada masa yang sama.

LANGKAH 3

Penguatan PCR

Seterusnya, letakkan plat di dalam mesin PCR, yang pada asasnya adalah pengitar haba.

RT-PCR masa nyata digunakan untuk mengesan novel coronavirus 2019 dengan menguatkan jujukan sasaran dalam gen RdrRP, gen E dan gen N.Pilihan gen sasaran bergantung pada urutan primer dan probe.

Langkah pertama RT-PCR ialah transkripsi terbalik.Untaian pertama DNA pelengkap disintesis, yang dimulakan oleh primer terbalik PCR, yang mengikat bahagian pelengkap genom RNA virus.Kemudian transkripase terbalik menambah nukleotida DNA ke hujung 3′ primer untuk mensintesis DNA pelengkap kepada RNA virus.Suhu dan tempoh langkah ini bergantung pada primer, RNA sasaran, dan transkripase terbalik yang digunakan.

Seterusnya, langkah denaturasi awal digunakan, yang menghasilkan denaturasi hibrid RNA-DNA.Langkah ini perlu untuk mengaktifkan polimerase DNA.Pada masa yang sama, transkripase terbalik dinyahaktifkan.

PCR terdiri daripada satu siri kitaran haba.Setiap kitaran terdiri daripada langkah denaturasi, penyepuhlindapan dan lanjutan.

Langkah denaturasi melibatkan pemanasan ruang tindak balas kepada 95 darjah Celsius dan menggunakannya untuk denaturasi templat DNA untai dua.

Dalam langkah seterusnya, suhu tindak balas dikurangkan kepada 58 darjah Celcius, membolehkan primer hadapan menyelinap ke bahagian pelengkap templat DNA untai tunggalnya.Suhu penyepuhlindapan secara langsung bergantung pada panjang dan komposisi primer.

Dalam langkah lanjutan, polimerase DNA mensintesis helai DNA baharu yang menjadi pelengkap kepada helai templat DNA.Dengan menambahkan nukleus bebas pelengkap kepada templat dalam arah 5'hingga 3'daripada campuran tindak balas.Suhu langkah ini bergantung kepada polimerase DNA yang digunakan.

Selepas kitaran pertama, sasaran DNA rantai dua diperolehi.

Kemudian, masukkan kitaran kedua.DNA untai dua didenaturasikan untuk menghasilkan dua molekul DNA untai tunggal.

Dalam langkah seterusnya, suhu tindak balas diturunkan, primer disepuhlindapkan pada setiap templat DNA beruntai tunggal, dan siasatan Taq-man disambungkan ke bahagian pelengkap DNA sasaran.

Probe TaqMan terdiri daripada fluorophore yang dihubungkan secara kovalen pada hujung 5'probe oligonucleotide.Apabila teruja oleh sumber cahaya kitar, fluorophore memancarkan pendarfluor.Selain itu, probe terdiri daripada pelindapkejutan pada hujung 3′.Kedekatan gen wartawan dengan pelindapkejut menghalang pengesanan pendarfluor.

Dalam langkah lanjutan, polimerase DNA mensintesis helai baru.Apabila polimerase mencapai probe TaqMan, aktiviti 5′nuclease endogennya membelah probe, memisahkan pewarna daripada pelindapkejut.

Dengan setiap kitaran PCR, lebih banyak molekul pewarna dibebaskan, mengakibatkan peningkatan dalam keamatan pendarfluor berkadar dengan bilangan amplikon yang disintesis.

Kaedah ini membolehkan untuk menganggarkan bilangan urutan tertentu yang terdapat dalam sampel.Bilangan serpihan DNA untai dua berganda dalam setiap kitaran.Oleh itu, PCR boleh digunakan untuk menganalisis sampel yang sangat kecil.

Untuk mengukur isyarat pendarfluor, lampu halogen tungsten, penapis pengujaan, pemantul, kanta, penapis pelepasan dan kamera CCD penggunaan peranti berganding cas.

LANGKAH 4 Mengesan

Untuk mengukur isyarat pendarfluor, lampu halogen tungsten, penapis pengujaan, pemantul, kanta, penapis pelepasan dan kamera CCD penggunaan peranti berganding cas.

Cahaya yang ditapis dari lampu dipantulkan oleh reflektor, melalui kanta pemeluwap, dan difokuskan ke tengah setiap lubang.Kemudian pendarfluor yang dipancarkan dari lubang dipantulkan dari cermin, melalui penapis pelepasan, dan dikesan oleh kamera CCD.Dalam setiap kitaran PCR, cahaya fluorofor yang teruja sendiri boleh dikesan oleh CCD.

Ia menukarkan cahaya yang ditangkap kepada data digital.Kaedah ini dipanggil PCR masa nyata, dan ia membenarkan pemantauan masa nyata kemajuan tindak balas PCR.