Semua orang bercakap tentang prinsip eksperimen qRT-PCR, reka bentuk primer, tafsiran hasil, dll., tetapi saya fikir saya harus berkongsi dengan anda operasi eksperimen qRT-PCR.Ia kecil, tetapi ia mengenai hasil.
Sebelum melakukan qRT-PCR, kita perlu mempunyai pemahaman yang jelas tentang RNA dan kaedah operasi kita sendiri.Lagipun, usaha kita bertujuan untuk mendapatkan hasil, bukannya hanya berlatih.Jadi sebelum melakukan qRT-PCR, kita perlu menentukan isu berikut (sesetengahnya hanya terpakai untuk SYBR).
1 Adakah anda pasti RNA anda tidak terdegradasi?
NanoDrop 2000 hanya boleh mengesan kepekatan dan ketulenan RNA, tetapi tidak dapat mengesan integriti RNA.
Nilai RNA (RNA Intesity Number) boleh mencerminkan integriti RNA, yang dikesan oleh sistem Bioanalyzer Agilent 2100.
Rajah skematik nilai RIN untuk sampel RNA yang berbeza (eukariota)
Walau bagaimanapun, makmal secara amnya tidak mempunyai Agilent 2100 Bioanalyzer.Dalam kes ini, kita boleh mengesan melalui gel formaldehid, tetapi keperluan untuk jumlah keseluruhan RNA adalah tinggi, jadi kaedah terpantas adalah menggunakan elektroforesis gel biasa.Ia dikehendaki berada dalam persekitaran bebas nuklease, jadi perlu membilas tangki elektroforesis, botol sol, kurungan gel dan sikat dengan air DEPC.Agarose juga bebas nuklease (selagi ia baru dibuka), dan Penampan Pemuatan harus dibuka dengan segar sebanyak mungkin, dengan 1.2% gel.
Ambil perhatian bahawa gel mesti dibubarkan sepenuhnya, jika tidak, ia akan menyebabkan jalur tidak homogen, seperti yang ditunjukkan dalam sampel 9 dalam rajah.Jika voltan terlalu tinggi atau berjalan terlalu lama akan menghasilkan haba dan menyebabkan kemerosotan RNA, jadi voltan dan masa harus dikawal dengan munasabah.Di samping itu, gel running juga boleh menentukan lagi sama ada terdapat sisa DNA dalam sampel, dan memerhati sama ada terdapat sejumlah besar jalur tertahan dalam telaga pendispensan.
Rajah.Pengesanan elektroforesis gel RNA
2 Adakah anda pasti tentang kepekatan cDNA anda?
Pengalaman abang-abang besar di makmal adalah bahawa cDNA sistem 20 ul yang diperolehi oleh setiap penyongsangan secara langsung dicairkan 20X, manakala adik-beradik pasca kedoktoran dicairkan 10X.Saya biasanya bergantung pada keadaan.Oleh kerana kualiti RNA yang disebut oleh setiap orang adalah berbeza, tahap pembalikan juga berbeza, dan teknologi pembalikan mungkin tidak stabil.
Jadi setiap kali saya mendapat cDNA terbalik, saya akan mencairkannya terlebih dahulu kira-kira 3 kali, dan kemudian menggunakan gen pengemasan untuk melakukan RT-PCR, bilangan kitaran biasanya 25 kitaran, untuk mengenal pasti kepekatan tertentu, dan kemudian menentukan faktor pencairan akhir.
3 Adakah anda pasti primer anda mudah digunakan?
Ia boleh melepasi keluk lebur qRT-PCR, tetapi ini masih memerlukan wang.Untuk makmal tanpa banyak wang, apabila mereka mendapat banyak primer, mereka boleh menggunakan RT-PCR biasa untuk melihat sama ada ia adalah satu jalur dan mengenal pasti kekhususan primer.Jika makmal tidak kekurangan wang, kekhususan semua primer boleh dikenal pasti sekali melalui lengkung lebur.
4 Adakah anda pasti bahawa keadaan percubaan anda sesuai?
SYBR harus dilindungi daripada cahaya yang kuat, jadi cuba matikan lampu atas apabila menambah reagen SYBR, dan hanya perlu menggunakan cahaya malap untuk melengkapkannya.
Simpan SYBR pada suhu 4°C.Apabila digunakan, terbalikkan perlahan-lahan ke atas dan ke bawah untuk sebati untuk mengelakkan berbuih, dan jangan vorteks dengan kuat.
Sesetengah adik perempuan suka melukis tanda di papan PCR kerana takut mencampurkan sampel, yang salah.Oleh kerana penanda anda berkemungkinan besar mempengaruhi pengumpulan isyarat pendarfluor, saya biasanya mengesyorkan junior menggunakan buku nota eksperimen untuk membantu dalam ingatan, seperti yang ditunjukkan di bawah.
Rajah.rajah pemuatan sampel qRT-PCR
5 Adakah anda pasti anda melakukannya dengan betul?
Pastikan anda memakai sarung tangan, memakai sarung tangan, memakai sarung tangan, dan sebut perkara penting tiga kali.
Untuk mengurangkan pendedahan SYBR kepada cahaya, saya secara peribadi suka menambah templat terlebih dahulu, seperti yang ditunjukkan dalam rajah di bawah.Mengikut pengalaman, penambahan sejumlah kecil templat berkemungkinan menyebabkan ralat pensampelan.Oleh itu, untuk meminimumkan ralat yang disebabkan oleh menambah sedikit templat, saya biasanya menggandakan sampel sekali lagi, dan menggandakan jumlah apabila menambah sampel untuk mengurangkan jumlah H2O2 yang ditambah.
Rajah.Gambarajah skematik pemuatan qRT-PCR
Kemudian konfigurasikan sistem qRT-PCR seperti berikut.
Rajah.rajah penyediaan sistem qRT-PCR
NOTA: Proses konfigurasi perlu dilakukan di atas ais.
Selepas menambah sampel, tampal filem pengedap lutsinar.Cuba untuk tidak menyentuh permukaan filem pengedap lutsinar dengan tangan anda, hanya beroperasi dari ruang di kedua-dua belah filem.Kerana cap jari juga boleh menjejaskan pengumpulan isyarat pendarfluor.Kemudian gunakan emparan untuk mengempar dengan cepat selama 10 saat pada kelajuan rendah untuk mengelakkan sampel daripada tergantung pada dinding.
Produk Berkaitan:
Masa siaran: Apr-28-2023
