RT-qPCR dibangunkan daripada teknologi PCR biasa.Ia menambahkan bahan kimia pendarfluor (pewarna pendarfluor atau probe pendarfluor) pada sistem tindak balas PCR tradisional, dan mengesan proses penyepuhlindapan dan pelanjutan PCR dalam masa nyata mengikut mekanisme pendarfluor mereka yang berbeza.Perubahan isyarat pendarfluor dalam medium digunakan untuk mengira jumlah perubahan produk dalam setiap kitaran PCR.Pada masa ini, kaedah yang paling biasa ialah kaedah pewarna pendarfluor dan kaedah kuar.

Kaedah pewarna pendarfluor:
Sesetengah pewarna pendarfluor, seperti SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, dsb., tidak mengeluarkan cahaya dengan sendirinya, tetapi memancarkan pendarfluor selepas terikat pada alur kecil dsDNA.Oleh itu, pada permulaan tindak balas PCR, mesin tidak dapat mengesan isyarat pendarfluor.Apabila tindak balas diteruskan kepada lanjutan penyepuhlindapan (kaedah dua langkah) atau peringkat lanjutan (kaedah tiga langkah), helai berganda dibuka pada masa ini, dan polimerase DNA baharu Semasa sintesis helai, molekul pendarfluor digabungkan dalam alur kecil dsDNA dan mengeluarkan pendarfluor.Apabila bilangan kitaran PCR meningkat, semakin banyak pewarna bergabung dengan dsDNA, dan isyarat pendarfluor juga terus dipertingkatkan.Ambil SYBR Green Ⅰ sebagai contoh.
Kaedah siasatan:
Kuar Taqman adalah kuar hidrolisis yang paling biasa digunakan.Terdapat kumpulan pendarfluor di hujung 5′ probe, biasanya FAM.Siasatan itu sendiri adalah urutan pelengkap kepada gen sasaran.Terdapat kumpulan pelindapkejutan pendarfluor pada hujung 3′ fluorofor.Mengikut prinsip pemindahan tenaga resonans pendarfluor (pemindahan tenaga resonans Förster, FRET), apabila kumpulan pendarfluor wartawan (molekul pendarfluor penderma) dan kumpulan pendarfluor pelindapkejutan (molekul pendarfluor akseptor) Apabila spektrum pengujaan bertindih dan jaraknya sangat dekat (7-10nm), pengujaan molekul pendarfluor yang lemah boleh digerakkan oleh molekul pendarfluor yang lemah. ened.Oleh itu, pada permulaan tindak balas PCR, apabila siasatan bebas dan utuh dalam sistem, kumpulan pendarfluor wartawan tidak akan mengeluarkan pendarfluor.Apabila penyepuhlindapan, primer dan probe mengikat pada templat.Semasa peringkat lanjutan, polimerase secara berterusan mensintesis rantai baru.Polimerase DNA mempunyai aktiviti exonuclease 5'-3'.Apabila mencapai probe, polimerase DNA akan menghidrolisis probe daripada templat, memisahkan kumpulan pendarfluor wartawan daripada kumpulan pendarfluor pelindapkejut, dan melepaskan isyarat pendarfluor.Memandangkan terdapat perhubungan satu dengan satu antara kuar dan templat, kaedah kuar adalah lebih unggul daripada kaedah pewarna dari segi ketepatan dan kepekaan ujian.

Rajah 1 Prinsip qRT-PCR

Reka bentuk primer
Prinsip:

Primer hendaklah direka bentuk di kawasan terpelihara siri asid nukleik dan mempunyai kekhususan.

Sebaik-baiknya menggunakan jujukan cDNA, dan jujukan mRNA juga boleh diterima.Jika tidak, ketahui reka bentuk rantau cd bagi jujukan DNA.
Panjang produk kuantitatif pendarfluor ialah 80-150bp, yang paling lama ialah 300bp, panjang primer biasanya antara 17-25 asas, dan perbezaan antara primer huluan dan hiliran tidak boleh terlalu besar.

Kandungan G+C adalah antara 40% dan 60%, dan 45-55% adalah yang terbaik.
Nilai TM adalah antara 58-62 darjah.
Cuba elakkan dimer primer dan dimer kendiri, (jangan muncul lebih daripada 4 pasang tapak pelengkap berturut-turut) struktur jepit rambut, jika tidak dapat dielakkan, jadikan ΔG<4.5kJ/mol* Jika anda tidak dapat memastikan bahawa gDNA telah dialih keluar semasa transkripsi terbalik Bersih, sebaiknya reka bentuk primer intron *3′ hujung untuk mengelakkan struktur AT/3′ yang berterusan untuk mengelakkan struktur AT, A/GC yang berterusan, dan T/GC tidak boleh diubah suai. ) primer dan bukan
khusus Homologi bagi jujukan heterogen yang dikuatkan sebaik-baiknya kurang daripada 70% atau mempunyai 8 homologi asas pelengkap.
Pangkalan data:
Carian CottonFGD mengikut kata kunci
Reka bentuk primer:
Reka bentuk primer IDT-qPCR

Rajah2 halaman alat reka bentuk primer dalam talian IDT

Paparan halaman hasil rajah3
Reka bentuk primer lncRNA:
lncRNA:langkah yang sama seperti mRNA.
miRNA:Prinsip kaedah gelung batang: Oleh kerana semua miRNA adalah jujukan pendek kira-kira 23 nt, pengesanan PCR langsung tidak dapat dilakukan, jadi alat jujukan gelung batang digunakan.Urutan gelung batang ialah DNA untai tunggal kira-kira 50 nt, yang boleh membentuk struktur jepit rambut dengan sendirinya.3 'Akhirnya boleh direka bentuk sebagai urutan pelengkap kepada serpihan separa miRNA, kemudian miRNA sasaran boleh disambungkan ke jujukan gelung batang semasa transkripsi terbalik, dan jumlah panjang boleh mencapai 70bp, yang selaras dengan panjang produk yang dikuatkan ditentukan oleh qPCR.Reka bentuk primer miRNA tailing .
Pengesanan khusus amplifikasi:
Pangkalan data letupan dalam talian: Letupan CottonFGD mengikut persamaan urutan
Local blast: Rujuk menggunakan Blast+ untuk melakukan local blast, linux dan macos boleh terus mewujudkan pangkalan data tempatan, sistem win10 juga boleh dilakukan selepas memasang ubuntu bash.Buat pangkalan data letupan tempatan dan letupan tempatan;buka ubuntu bash pada win10 .
Notis: Kapas tanah tinggi dan kapas pulau laut adalah tanaman tetraploid, jadi hasil letupan selalunya akan menjadi dua atau lebih padanan.Pada masa lalu, menggunakan cd NAU sebagai pangkalan data untuk melakukan letupan mungkin akan menemui dua gen homolog dengan hanya sedikit perbezaan SNP.Biasanya, kedua-dua gen homolog tidak boleh dipisahkan oleh reka bentuk primer, jadi ia dianggap sama.Jika terdapat indel yang jelas, primer biasanya direka pada indel, tetapi ini boleh menyebabkan struktur sekunder primer Tenaga bebas menjadi lebih tinggi, membawa kepada penurunan kecekapan amplifikasi, tetapi ini tidak dapat dielakkan.

Pengesanan struktur sekunder primer:
Langkah-langkah:buka oligo 7 → urutan templat input → tutup sub-tetingkap → simpan → cari buku asas pada templat, tekan ctrl+D untuk menetapkan panjang primer → menganalisis pelbagai struktur sekunder, seperti badan dimerisasi sendiri, heterodimer, jepit rambut, tidak sepadan, dan lain-lain. Dua gambar terakhir dalam Rajah 4 adalah hasil ujian primer.Hasil primer hadapan adalah baik, tiada struktur dimer dan jepit rambut yang jelas, tiada asas pelengkap berterusan, dan nilai mutlak tenaga bebas adalah kurang daripada 4.5, manakala primer belakang menunjukkan berterusan 6 asas adalah pelengkap, dan tenaga bebas ialah 8.8;di samping itu, dimer yang lebih serius muncul pada hujung 3′, dan dimer 4 tapak berturut-turut muncul.Walaupun tenaga bebas tidak tinggi, 3′ dimer Chl boleh menjejaskan kekhususan amplifikasi dan kecekapan amplifikasi secara serius.Di samping itu, adalah perlu untuk memeriksa penyepit rambut, heterodimer, dan ketidakpadanan.

Hasil pengesanan oligo7 Rajah3
Pengesanan kecekapan amplifikasi:
Kecekapan amplifikasi tindak balas PCR memberi kesan serius kepada keputusan PCR.Juga dalam qRT-PCR, kecekapan amplifikasi amat penting untuk keputusan kuantitatif.Keluarkan bahan, mesin dan protokol lain dalam penimbal tindak balas.Kualiti primer juga mempunyai pengaruh yang besar terhadap kecekapan amplifikasi qRT-PCR.Untuk memastikan ketepatan keputusan, kedua-dua kuantifikasi pendarfluor relatif dan kuantifikasi pendarfluor mutlak perlu mengesan kecekapan amplifikasi primer.Adalah diakui bahawa Kecekapan amplifikasi qRT-PCR yang berkesan adalah antara 85% dan 115%.Terdapat dua kaedah:
1. Kaedah lengkung standard:
a.Campurkan cDNA
b.Pencairan kecerunan
c.qPCR
d.Persamaan regresi linear untuk mengira kecekapan amplifikasi
2. LinRegPCR
LinRegPCR ialah program untuk analisis Data RT-PCR masa nyata, juga dipanggil data PCR kuantitatif (qPCR) berdasarkan SYBR Green atau kimia yang serupa.Program ini menggunakan data yang dibetulkan bukan garis asas, melakukan pembetulan garis dasar pada setiap sampel Secara berasingan, menentukan tetingkap lineariti dan kemudian menggunakan analisis regresi linear untuk memuatkan garis lurus melalui set data PCR.Dari cerun garisan ini kecekapan PCR setiap sampel individu dikira.Purata kecekapan PCR setiap amplikon dan nilai Ct setiap sampel digunakan untuk mengira kepekatan permulaan bagi setiap sampel, dinyatakan dalam unit pendarfluor arbitrari.Input dan output data adalah melalui hamparan Excel.Hanya sampel
pencampuran diperlukan, tiada kecerunan
langkah diperlukan:(Ambil Bole CFX96 sebagai contoh, bukan Mesin dengan ABI yang jelas)
percubaan:ia adalah eksperimen qPCR standard.
output data qPCR:LinRegPCR boleh mengecam dua bentuk fail output: RDML atau kuantifikasi hasil Amplifikasi.Malah, ia adalah nilai pengesanan masa nyata nombor kitaran dan isyarat pendarfluor oleh mesin, dan penguatan diperoleh dengan menganalisis nilai perubahan pendarfluor kecekapan segmen linear.
Pemilihan data: Secara teori, nilai RDML harus boleh digunakan.Dianggarkan bahawa masalah komputer saya ialah perisian tidak dapat mengenali RDML, jadi saya mempunyai nilai output excel sebagai data asal.Adalah disyorkan untuk melakukan saringan kasar data terlebih dahulu, seperti kegagalan menambah sampel, dsb. Mata boleh dipadamkan dalam data output (sudah tentu, anda tidak boleh memadamkannya, LinRegPCR akan mengabaikan titik ini pada peringkat kemudian)

Rajah5 eksport data qPCR

Rajah6 pemilihan sampel calon

Input data:Keputusan penguatan kelayakan terbuka.xls, → buka LinRegPCR → fail → baca dari excel → pilih parameter seperti ditunjukkan dalam Rajah 7 → OK → klik tentukan garis dasar

Rajah 7 langkah input data linRegPCR

Keputusan:Jika tiada pengulangan, tiada pengumpulan diperlukan.Sekiranya terdapat pengulangan, pengelompokan boleh diedit dalam kumpulan sampel, dan nama gen dimasukkan dalam pengecam, dan kemudian gen yang sama akan dikumpulkan secara automatik.Akhir sekali, klik pada fail, eksport excel, dan lihat hasilnya.Kecekapan amplifikasi dan keputusan R2 setiap telaga akan dipaparkan.Kedua, jika anda membahagikan kepada kumpulan, kecekapan amplifikasi purata yang diperbetulkan akan dipaparkan.Pastikan kecekapan amplifikasi setiap buku asas adalah antara 85% dan 115%.Jika ia terlalu besar atau terlalu kecil, ini bermakna kecekapan amplifikasi primer adalah lemah.

Rajah 8 Keputusan dan output data

Proses eksperimen:
Keperluan kualiti RNA:
Kesucian:1.72.0 menunjukkan bahawa mungkin terdapat sisa isothiocyanate.Asid nukleik bersih A260/A230 hendaklah sekitar 2 .Jika terdapat penyerapan yang kuat pada 230 nm, ia menunjukkan bahawa terdapat sebatian organik seperti ion phenate.Di samping itu, ia boleh dikesan oleh 1.5% elektroforesis gel agarose.Halakan penanda, kerana ssRNA tidak mempunyai denaturasi dan logaritma berat molekul tidak mempunyai hubungan linear, dan berat molekul tidak dapat dinyatakan dengan betul.Kepekatan: Secara teoribukankurang daripada 100ng/ul, jika kepekatan terlalu rendah, ketulenan umumnya rendah tidak tinggi

Gambar 9 gel RNA

Di samping itu, jika sampel itu berharga dan kepekatan RNA adalah tinggi, disyorkan untuk mengalihkannya selepas pengekstrakan, dan mencairkan RNA kepada kepekatan akhir 100-300ng/ul untuk transkripsi terbalik.Dalamproses transkripsi terbalik, apabila mRNA ditranskripsi, primer oligo (dt) yang secara khusus boleh mengikat ekor polyA digunakan untuk transkripsi terbalik, manakala lncRNA dan circRNA menggunakan primer heksamer rawak (Random 6 mer) untuk transkripsi terbalik jumlah RNA Untuk miRNA, primer gelung leher khusus miRNA digunakan untuk transkripsi terbalik.Banyak syarikat kini telah melancarkan kit tailing khas.Untuk kaedah gelung batang, kaedah tailing adalah lebih mudah, daya pemprosesan tinggi, dan penjimatan reagen, tetapi Kesan membezakan miRNA daripada keluarga yang sama seharusnya tidak sebaik kaedah gelung batang.Setiap kit transkripsi terbalik mempunyai keperluan untuk kepekatan primer khusus gen (gelung batang).Rujukan dalaman yang digunakan untuk miRNA ialah U6.Dalam proses penyongsangan gelung batang, tiub U6 hendaklah diterbalikkan secara berasingan, dan primer hadapan dan belakang U6 hendaklah ditambah terus.Kedua-dua circRNA dan lncRNA boleh menggunakan HKG sebagai rujukan dalaman.Dalampengesanan cDNA,
jika tiada masalah dengan RNA, cDNA juga harus baik.Walau bagaimanapun, jika kesempurnaan eksperimen diteruskan, sebaiknya gunakan gen rujukan dalaman (Gen rujukan, RG) yang boleh membezakan gDNA daripada cd.Secara amnya, RG ialah gen pengemasan., HKG) seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 10;Pada masa itu, saya sedang membuat protein simpanan kacang soya, dan menggunakan actin7 yang mengandungi intron sebagai rujukan dalaman.Saiz serpihan yang dikuatkan bagi primer ini dalam gDNA ialah 452bp, dan jika cDNA digunakan sebagai templat, ia adalah 142bp.Kemudian keputusan ujian mendapati bahawa Sebahagian daripada cDNA sebenarnya telah dicemari oleh gDNA, dan ia juga membuktikan bahawa tidak ada masalah dengan hasil transkripsi terbalik, dan ia boleh digunakan sebagai templat untuk PCR.Tidak berguna untuk menjalankan elektroforesis gel agarose secara langsung dengan cDNA, dan ia adalah jalur meresap, yang tidak meyakinkan.

Rajah 10 pengesanan cDNA

Penentuan syarat qPCRsecara amnya tiada masalah mengikut protokol kit, terutamanya dalam langkah nilai tm.Jika sesetengah primer tidak direka bentuk dengan baik semasa reka bentuk primer, mengakibatkan perbezaan yang besar antara nilai tm dan teori 60°C, adalah disyorkan bahawa cDNA Selepas sampel dicampur, jalankan PCR kecerunan dengan primer, dan cuba elakkan daripada menetapkan suhu tanpa jalur sebagai nilai TM.

Analisis data

Kaedah pemprosesan PCR kuantitatif pendarfluor relatif konvensional pada asasnya mengikut 2-ΔΔCT.Templat pemprosesan data.

Produk Berkaitan:

PCR Masa Nyata Mudah^TM –Taqman

PCR Masa Nyata Mudah^TM –SYBR HIJAU I

RT Easy I (Master Premix untuk sintesis cDNA untaian pertama)

RT Easy II(Master Premix untuk sintesis cDNA untaian pertama untuk qPCR)