一、Meningkatkan sensitiviti sistem tindak balas：

1. Asingkan RNA berkualiti tinggi：

Sintesis cDNA yang berjaya datang daripada RNA berkualiti tinggi.RNA berkualiti tinggi sekurang-kurangnya mestilah panjang penuh dan bebas daripada perencat transkripase terbalik seperti EDTA atau SDS.Kualiti RNA menentukan jumlah maksimum maklumat jujukan yang boleh anda transkripsikan ke dalam cDNA.Kaedah penulenan RNA biasa ialah kaedah satu langkah menggunakan guanidine isothiocyanate/fenol asid.Untuk mengelakkan pencemaran oleh jumlah surih RNase, RNA yang diasingkan daripada sampel yang kaya dengan RNase (seperti pankreas) perlu disimpan dalam formaldehid untuk mengekalkan RNA berkualiti tinggi, terutamanya untuk penyimpanan jangka panjang.RNA yang diekstrak daripada hati tikus pada dasarnya terdegradasi selepas disimpan di dalam air selama seminggu, manakala RNA yang diekstrak daripada limpa tikus kekal stabil selepas disimpan di dalam air selama 3 tahun.Di samping itu, transkrip yang lebih panjang daripada 4 kb lebih sensitif terhadap degradasi oleh RNase surih daripada transkrip kecil.Untuk meningkatkan kestabilan sampel RNA yang disimpan, RNA boleh dibubarkan dalam formamide ternyahion dan disimpan pada -70°C.Formamide yang digunakan untuk memelihara RNA mestilah bebas daripada serpihan yang merendahkan RNA.RNA daripada pankreas boleh dipelihara dalam formamide sekurang-kurangnya satu tahun.Apabila bersedia untuk menggunakan RNA, anda boleh menggunakan kaedah berikut untuk memendakan RNA: tambah NaCl kepada 0.2M dan 4 kali ganda isipadu etanol, letakkan pada suhu bilik selama 3-5 minit, dan sentrifuge pada 10,000×g selama 5 minit.

2. Gunakan RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase：

Perencat RNase sering ditambah kepada tindak balas transkripsi terbalik untuk meningkatkan panjang dan hasil sintesis cDNA.Perencat RNase perlu ditambah semasa tindak balas sintesis untaian pertama dengan kehadiran penimbal dan agen pengurangan (seperti DTT), kerana proses sebelum sintesis cDNA menyahturasi perencat, dengan itu melepaskan RNase terikat yang boleh merendahkan RNA.Perencat RNase protein hanya menghalang degradasi RNA oleh RNase A, B, C, dan tidak menghalang RNase pada kulit, jadi berhati-hati untuk tidak memperkenalkan RNase dari jari anda walaupun menggunakan perencat ini.

Transkripase terbalik memangkinkan penukaran RNA kepada cDNA.Kedua-dua M-MLV dan AMV mempunyai aktiviti RNaseH endogen sebagai tambahan kepada aktiviti polimerase mereka sendiri.Aktiviti RNaseH dan aktiviti polimerase bersaing antara satu sama lain untuk untaian hibrid yang terbentuk antara templat RNA dan primer DNA atau untaian lanjutan cDNA, dan merendahkan untaian RNA dalam kompleks RNA:DNA.Templat RNA yang direndahkan oleh aktiviti RNaseH tidak lagi boleh berfungsi sebagai substrat yang berkesan untuk sintesis cDNA, yang mengurangkan hasil dan panjang sintesis cDNA.Oleh itu, adalah berfaedah untuk menghapuskan atau mengurangkan aktiviti RNaseH transkripase terbalik.。

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase dan thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, boleh memperoleh lebih banyak jumlah dan lebih banyak cDNA panjang penuh daripada MMLV dan AMV.Sensitiviti RT-PCR akan dipengaruhi oleh jumlah sintesis cDNA.ThermoScript jauh lebih sensitif daripada AMV.Saiz produk RT-PCR dihadkan oleh keupayaan transkripase terbalik untuk mensintesis cDNA, terutamanya apabila mengklon cDNA yang lebih besar.Berbanding dengan MMLV, SuperScripⅡ meningkatkan hasil produk RT-PCR yang panjang dengan ketara.Transkripase terbalik RNaseH juga telah meningkatkan kestabilan suhu, jadi tindak balas boleh dilakukan pada suhu yang lebih tinggi daripada 37-42°C biasa.Di bawah keadaan sintesis yang dicadangkan, gunakan primer oligo(dT) dan 10 μCi [α-P]dCTP.Jumlah hasil helai pertama dikira menggunakan kaedah pemendakan TCA.CDNA panjang penuh dianalisis menggunakan jalur disusun saiz yang dipotong dan dikira pada gel agarose beralkali.

3. Naikkan suhu pengeraman untuk transkripsi terbalik：

Suhu pengeraman yang lebih tinggi membantu membuka struktur sekunder RNA, meningkatkan hasil tindak balas.Bagi kebanyakan templat RNA, mengeram RNA dan primer pada 65°C tanpa penimbal atau garam, diikuti dengan penyejukan pantas pada ais akan menghapuskan kebanyakan struktur sekunder dan membenarkan primer mengikat.Walau bagaimanapun, sesetengah templat masih mempunyai struktur sekunder, walaupun selepas denaturasi haba.Penguatan templat yang sukar ini boleh dilakukan menggunakan ThermoScript Reverse Transcriptase dan meletakkan tindak balas transkripsi terbalik pada suhu yang lebih tinggi untuk meningkatkan penguatan.Suhu pengeraman yang lebih tinggi juga boleh meningkatkan kekhususan, terutamanya apabila primer khusus gen (GSP) digunakan untuk sintesis cDNA (lihat Bab 3).Jika menggunakan GSP, pastikan Tm primer adalah sama dengan suhu pengeraman yang dijangkakan.Jangan gunakan oligo(dT) dan primer rawak melebihi 60°C.Primer rawak memerlukan pengeraman pada 25°C selama 10 minit sebelum meningkat kepada 60°C.Selain menggunakan suhu transkripsi songsang yang lebih tinggi, kekhususan juga boleh dipertingkatkan dengan memindahkan terus campuran RNA/primer daripada suhu denaturasi 65°C kepada suhu inkubasi transkripsi terbalik dan menambah campuran tindak balas 2× pra-panas (sintesis permulaan panas cDNA) .Pendekatan ini membantu menghalang pasangan bes antara molekul yang berlaku pada suhu yang lebih rendah.Pensuisan suhu berbilang yang diperlukan untuk RT-PCR boleh dipermudahkan dengan menggunakan kitar haba.

Polimerase termostabil Tth bertindak sebagai polimerase DNA dengan kehadiran Mg2+ dan sebagai polimerase RNA dengan kehadiran Mn2+.Ia boleh disimpan hangat pada suhu maksimum 65°C.Walau bagaimanapun, kehadiran Mn2+ semasa PCR mengurangkan kesetiaan, yang menjadikan polimerase Tth kurang sesuai untuk penguatan ketepatan tinggi, seperti pengklonan cDNA.Di samping itu, Tth mempunyai kecekapan transkripsi terbalik yang rendah, yang mengurangkan kepekaan, dan, memandangkan transkripsi terbalik dan PCR boleh dilakukan dengan satu enzim, tindak balas kawalan tanpa transkripsi terbalik tidak boleh digunakan untuk membandingkan produk penguatan cDNA dengan DNA genomik yang mencemari.Produk amplifikasi telah diasingkan.

4. Bahan tambahan yang menggalakkan transkripsi terbalik：

Aditif termasuk gliserol dan DMSO ditambah kepada tindak balas sintesis untai pertama, yang boleh mengurangkan kestabilan untai ganda asid nukleik dan membuka ikatan struktur sekunder RNA.Sehingga 20% gliserol atau 10% DMSO boleh ditambah tanpa menjejaskan aktiviti SuperScript II atau MMLV.AMV juga boleh bertolak ansur sehingga 20% gliserol tanpa kehilangan aktiviti.Untuk memaksimumkan sensitiviti RT-PCR dalam tindak balas transkripsi terbalik SuperScriptⅡ, 10% gliserol boleh ditambah dan diinkubasi pada 45°C.Jika 1/10 daripada produk tindak balas transkripsi terbalik ditambah kepada PCR, maka kepekatan gliserol dalam tindak balas amplifikasi ialah 0.4%, yang tidak mencukupi untuk menghalang PCR.

5. Rawatan RNaseH：

Rawatan tindak balas sintesis cDNA dengan RNaseH sebelum PCR boleh meningkatkan sensitiviti.Bagi sesetengah templat, adalah difikirkan bahawa RNA dalam tindak balas sintesis cDNA menghalang pengikatan produk penguatan, di mana rawatan RNaseH boleh meningkatkan sensitiviti.Secara amnya, rawatan RNaseH diperlukan apabila menguatkan templat sasaran cDNA penuh yang lebih panjang, seperti scherosis tuberous II salinan rendah.Untuk templat yang sukar ini, rawatan RNaseH meningkatkan isyarat yang dihasilkan oleh SuperScript II atau cDNA yang disintesis AMV.Untuk kebanyakan tindak balas RT-PCR, rawatan RNaseH adalah pilihan, kerana langkah denaturasi PCR pada 95°C secara amnya menghidrolisis RNA dalam kompleks RNA:DNA.

6. Penambahbaikan Kaedah Pengesanan RNA Kecil：

RT-PCR amat mencabar apabila hanya sejumlah kecil RNA yang tersedia.Glikogen ditambah sebagai pembawa semasa pengasingan RNA membantu meningkatkan hasil sampel kecil.Glikogen bebas RNase boleh ditambah pada masa yang sama dengan menambah Trizol.Glikogen adalah larut air dan boleh disimpan dalam fasa akueus dengan RNA untuk membantu pemendakan berikutnya.Untuk sampel kurang daripada 50 mg tisu atau 106 sel kultur, kepekatan glikogen bebas RNase yang disyorkan ialah 250 μg/ml.

Menambah BSA asetilasi pada tindak balas transkripsi terbalik menggunakan SuperScript II boleh meningkatkan sensitiviti, dan untuk jumlah RNA yang kecil, mengurangkan jumlah SuperScript II dan menambah 40 unit perencat nuklease RNaseOut boleh meningkatkan tahap pengesanan.Jika glikogen digunakan dalam proses pengasingan RNA, masih disyorkan untuk menambah perencat BSA atau RNase apabila menggunakan SuperScript II untuk tindak balas transkripsi terbalik.

二、Tingkatkan kekhususan RT-PCR

1. Asintesis CND：

Sintesis cDNA untaian pertama boleh dimulakan menggunakan tiga kaedah berbeza, kekhususan relatifnya mempengaruhi jumlah dan jenis cDNA yang disintesis.

Kaedah primer rawak adalah yang paling tidak spesifik daripada tiga kaedah.Primer menyepuh di beberapa tapak di seluruh transkrip, menghasilkan cDNA pendek dan separa panjang.Kaedah ini sering digunakan untuk mendapatkan jujukan akhir 5′ dan untuk mendapatkan cDNA daripada templat RNA dengan kawasan struktur sekunder atau dengan tapak penamatan yang tidak boleh direplikasi oleh transkripase terbalik.Untuk mendapatkan cDNA terpanjang, nisbah primer kepada RNA dalam setiap sampel RNA perlu ditentukan secara empirik.Kepekatan permulaan primer rawak adalah antara 50 hingga 250 ng setiap 20 μl tindak balas.Memandangkan cDNA yang disintesis daripada jumlah RNA menggunakan primer rawak adalah terutamanya RNA ribosom, poli(A)+RNA secara amnya dipilih sebagai templat.

Primer oligo(dT) lebih spesifik daripada primer rawak.Ia berhibrid kepada ekor poli(A) yang terdapat pada hujung 3' kebanyakan mRNA eukariotik.Oleh kerana poli(A)+ RNA adalah kira-kira 1% hingga 2% daripada jumlah RNA, jumlah dan kerumitan cDNA adalah lebih kurang daripada primer rawak.Oleh kerana kekhususannya yang tinggi, oligo(dT) secara amnya tidak memerlukan pengoptimuman nisbah RNA kepada primer dan pemilihan poli(A)+.Adalah disyorkan untuk menggunakan 0.5μg oligo(dT) setiap sistem tindak balas 20μl.oligo(dT)12-18 sesuai untuk kebanyakan RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR menawarkan oligo(dT)20 kerana kestabilan terma yang lebih baik untuk suhu pengeraman yang lebih tinggi.

Primer khusus gen (GSP) ialah primer paling spesifik untuk langkah transkripsi terbalik.GSP ialah oligonukleotida antisense yang boleh menghibridkan secara khusus kepada jujukan sasaran RNA, tidak seperti primer rawak atau oligo(dT), yang menyelinap kepada semua RNA.Peraturan yang sama digunakan untuk mereka bentuk primer PCR digunakan untuk reka bentuk GSP dalam tindak balas transkripsi terbalik.GSP boleh menjadi jujukan yang sama seperti primer amplifikasi yang menyelinap ke hujung 3'-paling mRNA, atau GSP boleh direka bentuk untuk menyepuh hiliran primer amplifikasi terbalik.Bagi sesetengah subjek yang diperkuatkan, lebih daripada satu primer antisense perlu direka bentuk untuk RT-PCR yang berjaya kerana struktur sekunder RNA sasaran boleh menghalang pengikatan primer.Adalah disyorkan untuk menggunakan 1 pmol antisense GSP dalam tindak balas sintesis untai pertama 20 μl.

2. Naikkan suhu pengeraman untuk transkripsi terbalik：

Untuk memanfaatkan sepenuhnya kelebihan penuh kekhususan GSP, transkripase terbalik dengan kestabilan suhu yang lebih tinggi harus digunakan.Transkripase songsang termostabil boleh diinkubasi pada suhu yang lebih tinggi untuk meningkatkan ketegasan tindak balas.Contohnya, jika GSP menyepuh pada 55°C, kekhususan GSP tidak akan digunakan sepenuhnya jika AMV atau M-MLV digunakan untuk transkripsi terbalik pada ketegasan rendah 37°C.Walau bagaimanapun, SuperScript II dan ThermoScript boleh bertindak balas pada 50°C atau lebih tinggi, yang akan menghapuskan produk tidak khusus yang dihasilkan pada suhu yang lebih rendah.Untuk kekhususan maksimum, campuran RNA/primer boleh dipindahkan terus daripada suhu denaturasi 65°C ke suhu inkubasi transkripsi terbalik dan ditambah kepada campuran tindak balas 2× pra-panas (permulaan panas sintesis cDNA).Ini membantu menghalang pasangan bes antara molekul pada suhu rendah.Peralihan suhu berganda yang diperlukan untuk RT-PCR boleh dipermudahkan dengan menggunakan kitar haba.

3. Mengurangkan pencemaran DNA genomik：

Kesukaran yang berpotensi dihadapi dengan RT-PCR ialah pencemaran DNA genom dalam RNA.Menggunakan kaedah pengasingan RNA yang baik, seperti Trizol Reagent, akan mengurangkan jumlah DNA genomik yang mencemarkan penyediaan RNA.Untuk mengelakkan produk yang diperoleh daripada DNA genomik, RNA boleh dirawat dengan DNase I gred amplifikasi untuk membuang DNA yang mencemari sebelum transkripsi terbalik.Pencernaan DNase I ditamatkan dengan mengeram sampel dalam 2.0 mM EDTA selama 10 minit pada 65 ° C.EDTA boleh mengelat ion magnesium, menghalang hidrolisis RNA bergantung kepada ion magnesium pada suhu tinggi.

Untuk memisahkan cDNA yang dikuatkan daripada mencemari produk penguatan DNA genomik, primer boleh direka bentuk supaya setiap penyepuhlindapan untuk memisahkan ekson.Produk PCR yang diperoleh daripada cDNA akan lebih pendek daripada yang diperoleh daripada DNA genomik yang tercemar.Di samping itu, eksperimen kawalan tanpa transkripsi terbalik dilakukan pada setiap templat RNA untuk menentukan sama ada serpihan yang diberikan diperoleh daripada DNA genom atau cDNA.Produk PCR yang diperoleh tanpa transkripsi terbalik diperoleh daripada genom.