Ⅰ. Meningkatkan sensitiviti sistem tindak balas:

1. Asingkan RNA berkualiti tinggi:

Sintesis cDNA yang berjaya datang daripada RNA berkualiti tinggi.RNA berkualiti tinggi harus memastikan sekurang-kurangnya jumlah lebih lama dan tidak mengandungi perencat yang tidak mengandungi enzim rakaman, seperti EDTA atau SDS.Kualiti RNA menentukan nilai maksimum maklumat jujukan yang boleh anda transkripsikan ke cDNA.Kaedah penulenan RNA am ialah kaedah langkah menggunakan isosianat/asidofenol.Untuk mengelakkan pencemaran RNase, RNA yang dipisahkan daripada sampel yang kaya dengan RNase (seperti pankreas) memerlukan penyimpanan formaldehid untuk menyelamatkan RNA berkualiti tinggi, lebih-lebih lagi untuk penyimpanan jangka panjang.RNA yang diekstrak daripada hati tikus pada asasnya terdegradasi selepas satu minggu penyimpanan di dalam air, manakala RNA yang diekstrak daripada limpa tikus kekal stabil selepas tiga tahun disimpan dalam air.Di samping itu, transkrip yang lebih besar daripada 4kb lebih sensitif untuk mengesan kemerosotan RNase daripada transkrip kecil.Untuk meningkatkan kestabilan sampel RNA penyimpanan, RNA boleh dibubarkan dalam ion methalmamine, dan disimpan -70 °C.Thylide yang digunakan untuk menyelamatkan RNA tidak boleh mengandungi pelbagai objek yang merendahkan RNA.RNA, yang berasal dari pankreas, boleh disimpan dalam methalmamine selama sekurang-kurangnya satu tahun.Apabila anda bersedia untuk menggunakan RNA, anda boleh menggunakan kaedah berikut untuk memendakan RNA: tambah NaCl kepada 0.2m dan 4 kali ganda isipadu etanol, letakkan suhu bilik selama 3-5 minit, dan 10,000 × g emparan selama 5 minit.

2. Gunakan transkripase terbalik tanpa aktiviti RNaseH (RNaseH-):

Perencat RNase sering ditambah kepada tindak balas transkripsi terbalik untuk meningkatkan panjang dan hasil sintesis cDNA.Perencat RNase ditambah dalam tindak balas sintesis rantai pertama dengan kehadiran penampan dan agen pengurangan seperti DTT kerana proses sintesis pra-cDNA menyahturasi perencat, dengan itu melepaskan RNases terikat yang merendahkan RNA.Perencat RNase protein hanya menghalang degradasi RNA oleh RNase A, B, C, dan tidak menghalang RNases pada kulit, jadi berhati-hati harus diambil untuk tidak memperkenalkan RNases dari jari walaupun menggunakan perencat ini.

Transkripase terbalik memangkinkan penukaran RNA kepada cDNA.Kedua-dua M-MLV dan AMV mempunyai aktiviti RNaseH endogen sebagai tambahan kepada aktiviti polimerase mereka sendiri.Aktiviti RNaseH bersaing dengan aktiviti polimerase untuk helai heterozigot yang terbentuk antara templat RNA dan primer DNA atau helai sambungan cDNA, dan merendahkan RNA: helai RNA dalam kompleks DNA.Templat RNA yang direndahkan oleh aktiviti RNaseH tidak lagi boleh digunakan sebagai substrat yang berkesan untuk sintesis cDNA, mengurangkan hasil dan panjang sintesis cDNA.Oleh itu, menghapuskan atau mengurangkan aktiviti RNaseH transkripase terbalik akan memberi manfaat yang besar.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase RNaseH- dan thermoScript reverse transcriptase, AMV RNaseH- menghasilkan lebih banyak cDNA penuh panjang berbanding MMLV dan AMV.Sensitiviti RT-PCR dipengaruhi oleh jumlah cDNA yang disintesis.ThermoScript jauh lebih sensitif daripada AMV.Saiz produk RT-PCR dihadkan oleh keupayaan transkripase terbalik untuk mensintesis cDNA, terutamanya apabila mengklon Cdna yang lebih besar.Berbanding dengan MMLV, SuperScripⅡ meningkatkan hasil produk RT-PCR yang panjang dengan ketara.Transkripase terbalik RNaseH- juga meningkatkan kestabilan terma, jadi tindak balas boleh dijalankan pada suhu yang lebih tinggi daripada biasa 37-42 ℃.Di bawah keadaan sintesis yang dicadangkan, primer oligo(dT) dan 10μCi [alpha-p]dCTP telah digunakan.Jumlah pengeluaran rantai pertama dikira menggunakan kaedah pemendakan TCA.CDNA panjang penuh dianalisis menggunakan penyingkiran jalur disusun saiz dan mengira dalam gel agarose beralkali.

3. Meningkatkan suhu pemeliharaan haba transkripsi terbalik：

Suhu pegangan yang lebih tinggi membantu membuka struktur sekunder RNA dan meningkatkan hasil tindak balas.Bagi kebanyakan templat RNA, menahan RNA dan primer pada suhu 65°C tanpa penimbal atau garam dan kemudian menyejukkannya dengan cepat di atas ais menghilangkan kebanyakan struktur sekunder dan membenarkan primer mengikat.Walau bagaimanapun, sesetengah templat masih mempunyai struktur sekunder, walaupun selepas denaturasi haba.Penguatan templat yang sukar ini boleh dilakukan menggunakan transkripase terbalik ThermoScript dan dengan meletakkan tindak balas transkripase terbalik pada suhu yang lebih tinggi untuk meningkatkan penguatan.Suhu pegangan yang lebih tinggi juga boleh meningkatkan kekhususan, terutamanya apabila sintesis cDNA dilakukan menggunakan primer khusus gen (GSPS) (lihat Bab 3).Jika menggunakan GSP, pastikan nilai Tm primer adalah sama dengan suhu pegangan yang dijangkakan.Jangan gunakan oligo(dT) dan primer rawak melebihi 60℃.Primer rawak perlu disimpan pada 25 ℃ selama 10 minit sebelum meningkat kepada 60 ℃.Di samping menggunakan suhu transkripsi songsang yang lebih tinggi, kekhususan boleh dipertingkatkan dengan memindahkan terus campuran RNA/ primer daripada suhu pendenaturan 65℃ kepada suhu pegangan transkripsi terbalik dan menambah campuran tindak balas 2× yang dipanaskan terlebih dahulu (sintesis permulaan haba cDNA).Pendekatan ini membantu menghalang pasangan bes antara molekul yang berlaku pada suhu yang lebih rendah.Menggunakan instrumen PCR memudahkan banyak suis suhu yang diperlukan untuk RT-PCR.

Polimerase terstabil haba Tth bertindak sebagai polimerase DNA dengan kehadiran Mg2+ dan polimerase RNA dengan kehadiran Mn2+.Ia boleh menahan haba sehingga 65 ℃.Walau bagaimanapun, kehadiran Mn2+ semasa PCR mengurangkan kesetiaan, yang menjadikan polimerase Tth kurang sesuai untuk penguatan ketepatan tinggi, seperti pengklonan cDNA.Di samping itu, Tth kurang cekap pada transkripsi terbalik, yang mengurangkan kepekaan, dan memandangkan satu enzim boleh melakukan transkripsi terbalik dan PCR, tindak balas kawalan tanpa transkripsi terbalik tidak boleh digunakan untuk membezakan produk cDNA yang diperkuat daripada DNA genom yang tercemar.

4. Aditif yang menggalakkan transkripsi terbalik：

Penambahan bahan tambahan, termasuk gliserin dan DMSO, kepada tindak balas sintesis rantai pertama boleh mengurangkan kestabilan helai berganda asid nukleik dan melepaskan struktur sekunder RNA.Sehingga 20% gliserin atau 10% DMSO boleh ditambah tanpa menjejaskan aktiviti SuperScriptⅡ atau MMLV.AMV juga boleh bertolak ansur sehingga 20% gliserol tanpa mengurangkan aktiviti.Untuk memaksimumkan sensitiviti RT-PCR dalam tindak balas transkripsi terbalik SuperScriptⅡ, 10% gliserol boleh ditambah dan ditebat pada 45 ℃.Jika 1/10 daripada produk tindak balas retrotranskripsi ditambah kepada PCR, kepekatan gliserol dalam tindak balas amplifikasi ialah 0.4%, yang tidak mencukupi untuk menghalang PCR.

5. Pemprosesan RNaseH：

Sensitiviti boleh dipertingkatkan dengan merawat tindak balas sintesis cDNA dengan RNaseH sebelum PCR.Bagi sesetengah templat, adalah dianggap bahawa RNA dalam tindak balas sintesis cDNA menghalang pengikatan produk yang diperkuatkan, dalam hal ini rawatan RNaseH boleh meningkatkan sensitiviti.Secara amnya, rawatan RNaseH diperlukan untuk penguatan templat sasaran cDNA penuh yang agak panjang, seperti scherosisⅡ tuberous dengan salinan rendah.Untuk templat yang sukar ini, RNaseH meningkatkan isyarat yang dijana oleh cDNA yang disintesis oleh SuperScriptⅡ atau AMV.Untuk kebanyakan tindak balas RT-PCR, rawatan RNaseH adalah pilihan kerana langkah denaturasi PCR terlindung 95℃ biasanya menghidrolisis RNA daripada RNA: kompleks DNA.

6. Kaedah yang lebih baik untuk mengesan sejumlah kecil RNA：

RT-PCR amat mencabar apabila hanya sejumlah kecil RNA yang tersedia.Penambahan glikogen sebagai pembawa semasa pemisahan RNA membantu meningkatkan hasil sampel kecil.Glikogen bebas RNase boleh ditambah pada masa yang sama dengan Trizol.Glikogen adalah larut air dan boleh kekal dalam fasa air dengan RNA untuk membantu dalam pemendakan berikutnya.Kepekatan glikogen bebas RNase yang disyorkan ialah 250μg/ml untuk sampel kurang daripada 50mg tisu atau 106 sel kultur.

Penambahan BSA asetilasi untuk membalikkan tindak balas transkripsi menggunakan SuperScriptⅡ boleh meningkatkan sensitiviti, dan untuk jumlah RNA yang kecil, mengurangkan jumlah SuperScriptⅡ dan menambah 40 unit perencat nuklease RnaseOut boleh meningkatkan tahap pengesanan.Jika glikogen digunakan dalam pengasingan RNA, penambahan perencat BSA atau RNase untuk membalikkan tindak balas transkripsi menggunakan SuperScriptⅡ masih disyorkan.

Ⅱ. Tingkatkan kekhususan RT-PCR

1. sintesis cNDA：

Tiga kaedah berbeza boleh digunakan untuk memulakan sintesis cDNA untaian pertama, dan kekhususan relatif setiap kaedah mempengaruhi jumlah dan jenis cDNA yang disintesis.

Kaedah primer rawak adalah yang paling tidak spesifik daripada tiga kaedah.Primer disepuhlindap di beberapa tapak sepanjang transkrip untuk menghasilkan cDNA panjang separa pendek.Kaedah ini sering digunakan untuk mendapatkan jujukan terminal 5′ dan cDNA daripada templat RNA dengan kawasan struktur sekunder atau dengan tapak penamat yang tidak boleh meniru transkripase terbalik.Untuk mendapatkan cDNA terpanjang, nisbah primer kepada RNA dalam setiap sampel RNA perlu ditentukan secara empirik.Kepekatan awal primer rawak berkisar antara 50 hingga 250ng setiap sistem tindak balas 20μl.Oleh kerana cDNA yang disintesis daripada jumlah RNA menggunakan primer rawak adalah terutamanya RNA ribosom, poli(A)+RNA secara amnya dipilih sebagai templat.

Permulaan Oligo(dT) lebih spesifik daripada primer rawak.Ia berhibrid dengan ekor poli(A) yang terdapat pada hujung 3′ mRNA dalam kebanyakan sel eukariotik.Oleh kerana poli(A)+RNA adalah kira-kira 1% hingga 2% daripada jumlah RNA, jumlah dan kerumitan cDNA adalah lebih rendah daripada jika primer rawak digunakan.Oleh kerana kekhususannya yang tinggi, oligo(dT) secara amnya tidak memerlukan pengoptimuman untuk nisbah RNA kepada primer dan pemilihan poli(A)+.Adalah disyorkan untuk menggunakan 0.5μg oligo(dT) setiap sistem tindak balas 20μl.oligo(dT)12-18 sesuai untuk kebanyakan RT-PCR.Sistem ThermoScript RT-PCR menyediakan oligo(dT)20 kerana kestabilan termanya yang baik dan sesuai untuk suhu pegangan yang lebih tinggi.

Primer khusus gen (GSP) ialah primer khusus terbaik untuk langkah transkripsi terbalik.GSP ialah oligonukleosida antisense yang boleh menghibridkan secara khusus dengan jujukan destinasi RNA, dan bukannya menyepuh semua Rna seperti primer rawak atau oligo(dT).Peraturan yang digunakan untuk mereka bentuk primer PCR juga digunakan untuk reka bentuk tindak balas transkripsi terbalik GSP.GSP boleh menjadi jujukan yang sama seperti primer amplifikasi yang disepuh pada penghujung mRNA3′, atau GSP boleh direka bentuk untuk disepuh hilir dengan primer penguatan terbalik.Untuk sesetengah objek yang dikuatkan, adalah perlu untuk mereka bentuk lebih daripada satu primer antisense untuk RT-PCR yang berjaya kerana struktur sekunder RNA sasaran boleh menghalang primer daripada mengikat.Adalah dicadangkan untuk menggunakan 1pmol antisense GSP dalam sistem tindak balas sintesis rantai pertama sebanyak 20μl.

2. Meningkatkan suhu pemeliharaan haba transkripsi terbalik：

Untuk memanfaatkan sepenuhnya kekhususan GSP, transkripase terbalik dengan kestabilan terma yang tinggi harus digunakan.Transkripase terbalik yang stabil haba boleh ditebat pada suhu yang lebih tinggi untuk meningkatkan ketegasan tindak balas.Contohnya, jika GSP disepuhlindapkan pada 55°C, maka kekhususan GSP tidak digunakan sepenuhnya jika transkripsi terbalik dilakukan pada 37°C dengan ketegasan rendah menggunakan AMV atau M-MLV.Walau bagaimanapun, SuperScripⅡ dan ThermoScript boleh bertindak balas pada 50℃ atau lebih tinggi, yang menghapuskan produk tidak spesifik yang dihasilkan pada suhu yang lebih rendah.Untuk kekhususan maksimum, campuran RNA/ primer boleh dipindahkan terus daripada suhu denaturasi 65 ℃ kepada suhu pegangan transkripsi terbalik dengan penambahan campuran tindak balas 2 x yang dipanaskan (permulaan terma sintesis cDNA).Ini membantu menghalang pasangan bes antara molekul pada suhu rendah.Menggunakan instrumen PCR memudahkan banyak peralihan suhu yang diperlukan untuk RT-PCR.

3. Kurangkan pencemaran DNA genomik：

Satu potensi kesukaran dengan RT-PCR ialah RNA mencemari DNA genom.Penggunaan kaedah pemisahan RNA yang lebih baik, seperti Trizol Reagent, mengurangkan pencemaran DNA genomik dalam persediaan RNA.Untuk mengelakkan produk yang dihasilkan daripada DNA genomik, RNA boleh dirawat dengan gred amplifikasi DnasⅠ untuk membuang DNA yang tercemar sebelum transkripsi terbalik.Sampel disimpan pada suhu 65 ℃ dalam 2.0mM EDTA selama 10 minit untuk menamatkan penghadaman DNaseⅠ.EDTA mengelat ion magnesium untuk menghalang hidrolisis RNA bergantung kepada ion magnesium yang berlaku pada suhu tinggi.

Untuk memisahkan cDNA yang dikuatkan daripada produk penguatan DNA genom, primer yang menyelinap secara berasingan dengan ekson yang dipisahkan boleh direka bentuk.Produk PCR yang diperoleh daripada cDNA akan lebih pendek daripada yang diperoleh daripada DNA genomik yang tercemar.Eksperimen terkawal tanpa transkripsi terbalik juga dilakukan pada setiap templat RNA untuk menentukan sama ada serpihan yang diberikan adalah daripada DNA genomik atau cDNA.Produk PCR yang diperolehi tanpa adanya transkripsi terbalik diperoleh daripada genom.

Produk Berkaitan

RT-PCR Mudah^ᵀᴹSaya (Satu Langkah)

-Kit satu langkah membolehkan transkripsi terbalik dan PCR dijalankan dalam tiub yang sama.Ia hanya perlu menambah RNA templat, primer PCR khusus dan ddH Bebas RNase₂O.

-Analisis kuantitatif masa nyata RNA boleh dijalankan dengan cepat dan tepat.

-Kit ini menggunakan reagen transkripsi terbalik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungkan dengan sistem tindak balas yang unik untuk meningkatkan kecekapan amplifikasi dan kekhususan tindak balas dengan berkesan.

-Sistem tindak balas yang dioptimumkan menjadikan tindak balas mempunyai kepekaan pengesanan yang lebih tinggi, kestabilan haba yang lebih kuat, dan toleransi yang lebih baik.

Pracampuran Induk RT Easy II(Dengan GDNase) Untuk Sintesis CDNA Tali Pertama Untuk PCR Masa Nyata Dengan GDNase

-Keupayaan cekap untuk mengeluarkan gDNA, yang boleh mengeluarkan gDNA dalam templat dalam masa 2 minit.

-Sistem transkripsi terbalik yang cekap, hanya mengambil masa 15 minit untuk menyelesaikan sintesis cDNA untai pertama.

-Templat kompleks: templat dengan kandungan GC tinggi dan struktur sekunder yang kompleks juga boleh diterbalikkan dengan kecekapan tinggi.

-Sistem transkripsi songsang sensitiviti tinggi, templat peringkat pg juga boleh mendapatkan cDNA berkualiti tinggi.

-Sistem transkripsi terbalik mempunyai kestabilan terma yang tinggi, suhu tindak balas optimum ialah 42 ℃, dan ia masih mempunyai prestasi transkripsi terbalik yang baik pada 50 ℃.