Baru-baru ini, saya menemui sesuatu yang menakjubkan!Ramai profesional percubaan lanjutan di sekelilingnya tidak mengetahui beberapa perkara pengetahuan percubaan yang sangat asas.

Sebagai contoh, bolehkah anda menjawab soalan berikut?

Adakah terdapat perbezaan antara OD260 dan A260?Apakah maksud masing-masing?
OD ialah singkatan kepada ketumpatan optik (ketumpatan optik), A ialah singkatan kepada penyerapan (absorbance), kedua-dua konsep itu sebenarnya sama, "ketumpatan optik" ialah "penyerapan", tetapi "ketumpatan optik" adalah selaras dengan kebanyakan piawaian kebangsaan dan lebih standard.

Biasanya kita mengukur nilai OD pada 260nm untuk mengira kepekatan asid nukleik, jadi apakah yang diwakili oleh 1OD?
Asid nukleik mempunyai puncak penyerapan maksimum pada panjang gelombang 260nm, yang mengandungi kedua-dua DNA dan RNA, serta serpihan asid nukleik yang berpecah-belah (ini adalah perkara utama).
Nilai OD yang diukur pada panjang gelombang 260 nm direkodkan sebagai OD260.Jika sampel tulen, nilai OD260 boleh mengira kepekatan sampel asid nukleik.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (DNA beruntai dua)
=37 μg/ml ssDNA (DNA untai tunggal)
=40 μg/ml RNA
=30 μg/ml dNTPs (oligonukleotida)
Adakah terdapat sebarang sambungan dan perbezaan antara RT-PCR, Realtime-PCR dan QPCR?
RT-PCR ialah singkatan untuk Reverse Transcription PCR
PCR Masa Nyata=qPCR, singkatan kepada PCR Masa Nyata Kuantitatif
Walaupun PCR Masa Nyata (PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata) dan PCR Transkripsi Songsang (PCR transkripsi terbalik) kedua-duanya nampaknya disingkatkan sebagai RT-PCR.Tetapi konvensyen antarabangsa ialah: RT-PCR secara khusus merujuk kepada PCR transkripsi terbalik.

Apakah nt, bp, dan kb yang biasa digunakan untuk menerangkan panjang DNA/RNA dalam biologi?
nt = nukleotida
bp = pasangan asas pasangan asas
kb = kilobase

Sudah tentu, anda akan mengatakan bahawa ramai orang tidak mengambil berat tentang butiran kecil ini!Semua orang melakukan ini, dan tiada siapa yang akan bertanya kepada anda apa itu.Anda tahu ini tidak perlu, bukan?

Tidak, Tidak, Tidak, sangat perlu untuk mengetahui perkara ini!kerana yang mana?
Kerana anda ingin menyiarkan artikel!Abang!Sama ada anda menyasarkan untuk tamat pengajian atau mengejar pencapaian penyelidikan saintifik, anda mesti bergantung pada artikel untuk bercakap!

Pengekstrakan asid nukleik harus menjadi eksperimen yang paling mudah dan paling asas.Kualiti pengekstrakan asid nukleik secara langsung menentukan keputusan eksperimen seterusnya.

Walaupun dah banyak kali cakap, masih ramai kawan-kawan yang tak ambil kisah.Kali ini saya memutuskan untuk keluar dari artikel itu!

Maklumat Minimum untuk Penerbitan Eksperimen PCR Masa Nyata Kuantitatif, dirujuk sebagai MIQE, ialah satu set garis panduan percubaan kuantitatif pendarfluor yang dilancarkan di peringkat antarabangsa, yang mencadangkan piawaian minimum untuk maklumat eksperimen yang diperlukan untuk menilai eksperimen PCR kuantitatif pendarfluor dan menerbitkan artikel.Melalui keadaan eksperimen dan kaedah analisis yang disediakan oleh penguji, penyemak boleh menilai dengan lebih baik kesahihan skema eksperimen penyelidik.

Dapat dilihat bahawa dalam bahagian pengekstrakan asid nukleik, item pengesanan berikut telah dicadangkan,

“E” menunjukkan maklumat yang mesti disediakan dan “D” menunjukkan maklumat yang perlu diberikan jika perlu.

Bentuknya sangat rumit, sebenarnya, saya ingin mengatakan bahawa semua orang perlu bermula dari

ketulenan (D), hasil (D), integriti (E) dan ketekalan (E) untuk menilai asid nukleik dalam empat aspek ini.

Menurut tabiat eksperimen, mula-mula bercakap tentang kaedah penilaian kesucian dan penumpuan.

Pengukuran OD ialah kaedah pengesanan kegemaran dan paling mudah untuk penguji.Mengenai prinsipnya, saya tidak akan menerangkan secara terperinci di sini.Banyak makmal kini menggunakan spektrofotometer ultra-mikro untuk secara langsung menganalisis sampel asid nukleik secara kuantitatif.Semasa memaparkan nilai penyerapan, program secara langsung memberikan nilai kepekatan (asid nukleik, protein dan pewarna pendarfluor) dan nisbah yang berkaitan.Bagi analisis nilai OD, Simpan gambar ini dan anda akan baik-baik saja.

Senarai penyelesaian nilai OD universal

Walau bagaimanapun, terdapat beberapa kaveat yang perlu dikemukakan secara berasingan untuk anda.

(Lagipun, saya tahu anda mesti menjadi orang yang menyimpan dan menunggu sehingga anda memerlukannya!)

Nota 1 Peralatan

Nilai OD akan dipengaruhi oleh peralatan yang berbeza.Selagi OD260 berada dalam julat tertentu, nilai OD230 dan OD280 adalah bermakna.Sebagai contoh, julat penyerapan Eppendorf D30 biasa pada 260nm ialah 0~3A, dan NanoDrop One of Thermo berada pada 260nm.Julat penyerapan 0.5~62.5A.

Nota 2Reagen pencairan

Nilai OD boleh dipengaruhi oleh pencairan reagen yang berbeza.Contohnya, bacaan OD260/280 RNA yang telah dimurnikan dalam pH7.5 10mM Trispenimbal adalah antara 1.9-2.1, manakala dalamlarutan akueus neutralnisbahnya akan menjadi lebih rendah, mungkin hanya 1.8-2.0, tetapi ini tidak bermakna kualiti RNA berubah Perbezaan.

Nota 3Bahan sisa

Kewujudan bahan sisa akan menjejaskan ketepatan pengukuran kepekatan asid nukleik, jadi perlu mengelakkan sisa protein, fenol, polisakarida dan polifenol dalam sampel asid nukleik sebanyak mungkin.

Walau bagaimanapun, sebenarnya, pengekstrakan dengan reagen organik adalah kaedah lama.Dalam kit komersial, kesan pengekstrakan boleh dicapai melalui lajur penjerapan berasaskan silika yang digabungkan dengan sentrifugasi, mengelakkan reagen organik toksik dan berbahaya yang sukar dibuang, dsb. Masalahnya, sepertiKit pengekstrakan asid nukleik Foregene, tidak menggunakan DNase/RNase dan reagen organik toksik sepanjang operasi, cepat dan selamat, dan jugakesan ialahbaik(sengaja cakap botak tu, tapi saya tahu awak nak tahu).

Contoh 1: Pengekstrakan DNA genomik hasil dan ketulenan

Kit Pengasingan DNA Tanah Foregene (DE-05511) merawat sampel tanah daripada pelbagai sumber, dan jumlah serta ketulenan DNA genomik yang diperoleh ditunjukkan dalam jadual berikut:
Contoh 2: Hasil dan ketulenan pengekstrakan RNA tisu

Kit Pengasingan RNA Jumlah Haiwan (RE-03012) memproses pelbagai sampel tisu, dan jumlah serta ketulenan RNA yang diperoleh ditunjukkan dalam jadual di bawah (untuk tisu tikus):
Walau bagaimanapun, jangan fikir anda telah selesai dengan nilai OD.Adakah anda mempunyai sebarang perkara penting yang saya lukiskan untuk anda di hadapan?

Notis

Molekul asid nukleik yang terpecah juga akan dikira dalam penyerapan.Dengan mengandaikan bahawa anda mempunyai sisa DNA genom dalam RNA, nilai OD anda akan kelihatan sangat tinggi, tetapi kepekatan sebenar RNA tidak dapat ditentukan.Sama ada RNA anda Tidak jelas sama ada terdapat kemerosotan, jadi kami masih memerlukan kaedah penilaian yang komprehensif untuk memberikan pertimbangan yang lebih tepat, iaitu, penilaian integriti asid nukleik yang disebutkan dalam MIQE.