• PCR ialah kaedah yang digunakan untuk menguatkan DNA daripada sejumlah kecil templat DNA.RT-PCR menggunakan transkripsi terbalik untuk menghasilkan templat DNA daripada sumber RNA yang kemudiannya boleh dikuatkan.
• PCR dan RT-PCR lazimnya ialah tindak balas titik akhir, manakala qPCR dan RT-qPCR menggunakan kinetik kadar sintesis produk semasa tindak balas PCR untuk mengukur jumlah templat yang ada.
• Kaedah yang lebih baru, seperti PCR digital, menyediakan kuantiti mutlak templat DNA awal, manakala kaedah seperti PCR isoterma mengurangkan keperluan peralatan mahal untuk memberikan hasil yang boleh dipercayai.

Tindak balas rantai polimerase (PCR) ialah teknik biologi molekul yang agak mudah dan digunakan secara meluas untuk menguatkan dan mengesan urutan DNA dan RNA.Berbanding dengan kaedah tradisional pengklonan dan penguatan DNA, yang selalunya boleh mengambil masa beberapa hari, PCR hanya memerlukan beberapa jam.PCR sangat sensitif dan memerlukan templat minimum untuk pengesanan dan penguatan jujukan tertentu.Kaedah asas PCR telah lebih maju daripada pengesanan DNA dan RNA yang mudah.Di bawah, kami telah memberikan gambaran keseluruhan kaedah PCR yang berbeza dan reagen yang kami sediakan di Enzo Life Sciences untuk keperluan penyelidikan anda.Kami berhasrat untuk membantu saintis mengakses reagen PCR dengan cepat untuk digunakan dalam projek penyelidikan mereka yang seterusnya!

PCR

Untuk PCR standard, semua yang anda perlukan ialah polimerase DNA, magnesium, nukleotida, primer, templat DNA yang akan dikuatkan, dan mesin termos.Mekanisme PCR adalah semudah tujuannya: 1) DNA beruntai dua (dsDNA) didenaturasi haba, 2) primer sejajar dengan untaian DNA tunggal, dan 3) primer dilanjutkan oleh polimerase DNA, menghasilkan dua salinan untaian DNA asal.Proses denaturasi, penyepuhlindapan dan pemanjangan sepanjang siri suhu dan masa dikenali sebagai satu kitaran penguatan (Rajah 1).

Setiap langkah kitaran hendaklah dioptimumkan untuk templat dan set primer yang digunakan.Kitaran ini diulang kira-kira 20-40 kali, dan produk yang dikuatkan kemudiannya boleh dianalisis, biasanya dengan gel agarose (Rajah 2).

Memandangkan PCR adalah kaedah yang sangat sensitif dan volum yang sangat kecil diperlukan untuk tindak balas tunggal, penyediaan campuran induk untuk beberapa tindak balas adalah disyorkan.Campuran induk mesti dicampur dengan baik dan kemudian dibahagikan mengikut bilangan tindak balas, memastikan setiap tindak balas akan mengandungi jumlah enzim, dNTP dan primer yang sama.Banyak pembekal, seperti Enzo Life Sciences, juga menawarkan campuran PCR yang sudah mengandungi segala-galanya kecuali primer dan templat DNA.

Kawasan yang kaya dengan Guanine/Cytosine (kaya GC) mewakili cabaran dalam teknik PCR standard.Jujukan yang kaya dengan GC adalah lebih stabil daripada jujukan dengan kandungan GC yang lebih rendah.Tambahan pula, jujukan yang kaya dengan GC cenderung membentuk struktur sekunder, seperti gelung jepit rambut.Akibatnya, helai berganda yang kaya dengan GC sukar dipisahkan sepenuhnya semasa fasa denaturasi.Akibatnya, polimerase DNA tidak boleh mensintesis untaian baru tanpa halangan.Suhu denaturasi yang lebih tinggi boleh memperbaiki keadaan ini, dan pelarasan ke arah suhu penyepuhlindapan yang lebih tinggi dan masa penyepuhlindapan yang lebih pendek boleh menghalang pengikatan primer yang kaya dengan GC yang tidak spesifik.Reagen tambahan boleh meningkatkan penguatan jujukan yang kaya dengan GC.DMSO, gliserol, dan betaine membantu mengganggu struktur sekunder yang disebabkan oleh interaksi GC dan dengan itu memudahkan pemisahan helai berganda.

PCR Mula Panas

Penguatan tidak spesifik adalah masalah yang boleh berlaku semasa PCR.Kebanyakan polimerase DNA yang digunakan untuk PCR berfungsi paling baik pada suhu sekitar 68°C hingga 72°C.Enzim boleh, bagaimanapun, juga aktif pada suhu yang lebih rendah, walaupun pada tahap yang lebih rendah.Pada suhu yang jauh di bawah suhu penyepuhlindapan, primer boleh mengikat secara tidak spesifik dan membawa kepada penguatan tidak spesifik, walaupun jika tindak balas ditetapkan pada ais.Ini boleh dicegah dengan menggunakan perencat polimerase yang berpisah daripada polimerase DNA hanya apabila suhu tertentu dicapai, maka istilah PCR permulaan panas.Inhibitor boleh menjadi antibodi yang mengikat polimerase dan denatur pada suhu denaturasi awal (biasanya 95°C).

Polimerase Kesetiaan Tinggi

Walaupun polimerase DNA menguatkan dengan agak tepat kepada jujukan templat asal, kesilapan dalam padanan nukleotida boleh berlaku.Ketidakpadanan dalam aplikasi seperti pengklonan boleh mengakibatkan transkrip terpenggal, dan salah terjemahan atau protein tidak aktif di hiliran.Untuk mengelakkan ketidakpadanan ini, polimerase dengan aktiviti "membaca pruf" telah dikenal pasti dan dimasukkan ke dalam aliran kerja.Polimerase pruf pertama, Pfu, telah dikenal pasti pada tahun 1991 dalam Pyrococcus furiosus.Enzim Pfu ini mempunyai aktiviti exonuclease 3' hingga 5'.Apabila DNA dikuatkan, exonuclease mengeluarkan nukleotida yang tidak sepadan pada hujung 3' helai.Nukleotida yang betul kemudian diganti, dan sintesis DNA diteruskan.Pengenalpastian jujukan nukleotida yang salah adalah berdasarkan pertalian pengikatan untuk trifosfat nukleosida yang betul dengan enzim, di mana pengikatan yang tidak cekap memperlahankan sintesis dan membolehkan penggantian yang betul.Aktiviti membaca pruf polimerase Pfu menghasilkan ralat yang lebih sedikit dalam urutan akhir berbanding polimerase DNA Taq.Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, enzim pembacaan pruf lain telah dikenal pasti, dan pengubahsuaian enzim Pfu asal telah dibuat untuk mengurangkan lagi kadar ralat semasa penguatan DNA.

RT-PCR

PCR transkripsi terbalik, atau RT-PCR, membenarkan penggunaan RNA sebagai templat.Langkah tambahan membolehkan pengesanan dan penguatan RNA.RNA ditranskripsi terbalik ke dalam DNA pelengkap (cDNA), menggunakan transkripase terbalik.Kualiti dan ketulenan templat RNA adalah penting untuk kejayaan RT-PCR.Langkah pertama RT-PCR ialah sintesis hibrid DNA/RNA.Transkripase terbalik juga mempunyai fungsi RNase H, yang merendahkan bahagian RNA hibrid.Molekul DNA untai tunggal kemudiannya dilengkapkan oleh aktiviti polimerase DNA yang bergantung kepada DNA transkripase terbalik ke dalam cDNA.Kecekapan tindak balas untaian pertama boleh menjejaskan proses penguatan.Dari sini, prosedur PCR standard digunakan untuk menguatkan cDNA.Kemungkinan untuk mengembalikan RNA ke cDNA oleh RT-PCR mempunyai banyak kelebihan, dan ia digunakan terutamanya untuk analisis ekspresi gen.RNA adalah untai tunggal dan sangat tidak stabil, yang menjadikannya mencabar untuk digunakan.Ia biasanya berfungsi sebagai langkah pertama dalam qPCR, yang mengukur transkrip RNA dalam sampel biologi.

qPCR dan RT-qPCR

PCR Kuantitatif (qPCR) digunakan untuk mengesan, mencirikan dan mengukur asid nukleik untuk pelbagai aplikasi.Dalam RT-qPCR, transkrip RNA sering dikira dengan mentranskripsi terbaliknya ke dalam cDNA terlebih dahulu, seperti yang diterangkan di atas, dan kemudiannya qPCR dijalankan.Seperti dalam PCR standard, DNA dikuatkan dengan tiga langkah berulang: denaturasi, penyepuhlindapan, dan pemanjangan.Walau bagaimanapun, dalam qPCR, pelabelan pendarfluor membolehkan pengumpulan data semasa PCR berkembang.Teknik ini mempunyai banyak faedah kerana pelbagai kaedah dan kimia yang ada.

Dalam qPCR berasaskan pewarna (biasanya hijau), pelabelan pendarfluor membenarkan kuantifikasi molekul DNA yang diperkuatkan dengan menggunakan penggunaan pewarna pengikat dsDNA.Semasa setiap kitaran, pendarfluor diukur.Isyarat pendarfluor meningkat secara berkadar dengan jumlah DNA yang direplikasi.Oleh itu, DNA dikira dalam "masa nyata" (Rajah 3).Kelemahan qPCR berasaskan pewarna ialah hanya satu sasaran boleh diperiksa pada satu masa dan pewarna itu akan mengikat mana-mana ds-DNA yang terdapat dalam sampel.

Dalam qPCR berasaskan probe, banyak sasaran boleh dikesan serentak dalam setiap sampel, tetapi ini memerlukan pengoptimuman dan reka bentuk probe khusus sasaran yang digunakan sebagai tambahan kepada primer.Beberapa jenis reka bentuk probe tersedia, tetapi jenis yang paling biasa ialah probe hidrolisis, yang menggabungkan fluorophore dan pelindapkejut.Pemindahan tenaga resonans pendarfluor (FRET) menghalang pancaran fluorophore melalui pelindapkejut semasa probe masih utuh.Walau bagaimanapun, semasa tindak balas PCR, probe dihidrolisiskan semasa lanjutan primer dan penguatan jujukan khusus yang terikat padanya.Pembelahan probe memisahkan fluorophore daripada pelindapkejut dan menghasilkan peningkatan yang bergantung kepada amplifikasi dalam pendarfluor (Rajah 4).Oleh itu, isyarat pendarfluor daripada tindak balas qPCR berasaskan probe adalah berkadar dengan jumlah jujukan sasaran probe yang terdapat dalam sampel.Oleh kerana qPCR berasaskan probe lebih spesifik daripada qPCR berasaskan pewarna, ia selalunya teknologi yang digunakan dalam ujian diagnostik berasaskan qPCR.

Penguatan Isoterma

Teknik PCR yang dinyatakan di atas memerlukan peralatan kitar termo yang mahal untuk menaikkan dan menurunkan suhu ruang dengan tepat untuk langkah denaturasi, penyepuhlindapan dan sambungan.Beberapa teknik telah dibangunkan yang tidak memerlukan peranti yang tepat dan boleh dilakukan dalam mandi air yang mudah atau bahkan dalam sel yang diminati.Teknik ini secara kolektif dipanggil penguatan isoterma dan berfungsi berdasarkan penguatan eksponen, linear atau lata.

Jenis penguatan isoterma yang paling terkenal ialah penguatan isoterma pengantara gelung, atau LAMP.LAMP menggunakan penguatan eksponen pada 65⁰C untuk menguatkan DNA atau RNA templat.Apabila melakukan LAMP, empat hingga enam primer yang melengkapi kawasan DNA sasaran digunakan dengan polimerase DNA untuk mensintesis DNA baharu.Dua daripada primer ini mempunyai jujukan percuma yang mengecam jujukan dalam primer lain dan mengikatnya, membenarkan struktur "gelung" terbentuk dalam DNA yang baru disintesis yang kemudiannya membantu penyepuhlindapan primer dalam pusingan penguatan berikutnya.LAMP boleh divisualisasikan dengan pelbagai kaedah, termasuk pendarfluor, elektroforesis gel agarose, atau kolorimetri.Kemudahan untuk menggambarkan dan mengesan kehadiran atau ketiadaan produk melalui kolorimetri dan kekurangan peralatan mahal yang diperlukan menjadikan LAMP sebagai pilihan yang sesuai untuk ujian SARS-CoV-2 di kawasan di mana ujian makmal klinikal tidak tersedia, atau penyimpanan dan pengangkutan sampel tidak boleh dilaksanakan, atau dalam makmal yang sebelum ini tidak mempunyai peralatan kitar termos PCR.