Asas reka bentuk primer (99% masalah boleh diselesaikan)
1. Panjang primer: Buku teks memerlukan 15-30bp, biasanya kira-kira 20bp.Keadaan sebenar adalah lebih baik untuk menjadi 18-24bp untuk memastikan kekhususan, tetapi semakin lama semakin baik, buku asas yang terlalu panjang juga akan mengurangkan kekhususan, dan mengurangkan hasil.
2. Jangka penguatan primer: 200-500bp adalah sesuai, dan serpihan boleh dikembangkan kepada 10kb dalam keadaan tertentu.
3. Asas primer: Kandungan G+C hendaklah 40-60%, terlalu sedikit kesan amplifikasi G+C tidak baik, terlalu banyak G+C mudah untuk muncul jalur bukan khusus.ATGC paling baik diagihkan secara rawak, mengelakkan kelompok lebih daripada 5 purin atau pirimidin nukleotida.Multi-gc untuk jujukan hujung 5′ dan pertengahan untuk meningkatkan kestabilan, elakkan GC kaya pada hujung 3′, tiada GC untuk 3 pangkalan terakhir, atau tiada GC untuk 3 daripada 5 pangkalan terakhir.
4. Elakkan struktur sekunder dalam primer, dan elakkan pelengkap antara dua primer, terutamanya pelengkap pada hujung 3 ', jika tidak dimer primer akan terbentuk dan jalur yang dikuatkan tidak spesifik akan dihasilkan.
5. Tapak pada 3 'hujung primer, terutamanya asas terakhir dan kedua terakhir, harus dipasangkan dengan ketat untuk mengelakkan kegagalan PCR akibat pangkalan terminal tidak berpasangan.
6. Primer mempunyai atau boleh ditambah dengan tapak belahan yang sesuai, dan jujukan sasaran yang dikuatkan sebaiknya mempunyai tapak belahan yang sesuai, yang sangat bermanfaat untuk analisis belahan atau pengklonan molekul.
7. Kekhususan primer: primer seharusnya tidak mempunyai homologi yang jelas dengan jujukan lain dalam pangkalan data jujukan asid nukleik.
8. Belajar menggunakan perisian: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Reka bentuk dalam talian ini berfungsi dengan baik).
Kandungan di atas boleh menyelesaikan sekurang-kurangnya 99% masalah reka bentuk primer.
Kawal butiran reka bentuk primer
1. Panjang primer
Panjang primer umum ialah 18~30 tapak.Secara amnya, faktor terpenting yang menentukan suhu penyepuhlindapan primer ialah panjang primer.Suhu penyepuhlindapan primer biasanya dipilih (nilai Tm -5 ℃), dan sesetengahnya menggunakan nilai Tm secara langsung.Formula berikut boleh digunakan untuk mengira secara kasar suhu penyepuhlindapan primer.
Apabila panjang primer kurang daripada 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Apabila panjang primer lebih besar daripada 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/panjang-5℃
Di samping itu, banyak perisian juga boleh digunakan untuk mengira suhu penyepuhlindapan, prinsip pengiraan akan berbeza, jadi kadangkala nilai yang dikira mungkin mempunyai jurang yang kecil.Untuk mengoptimumkan tindak balas PCR, primer terpendek yang memastikan suhu penyepuhlindapan tidak kurang daripada 54 ℃ digunakan untuk kecekapan dan kekhususan terbaik.
Secara keseluruhannya, kekhususan primer meningkat dengan faktor empat untuk setiap nukleotida tambahan, supaya panjang primer minimum untuk kebanyakan aplikasi ialah 18 nukleotida.Had atas panjang primer tidak begitu penting, terutamanya berkaitan dengan kecekapan tindak balas.Disebabkan entropi, semakin panjang primer, semakin rendah kadar penyepuhlindapan untuk mengikat DNA sasaran untuk membentuk templat untai dua yang stabil untuk DNA polimerase mengikat.
Apabila menggunakan perisian untuk mereka bentuk primer, panjang primer boleh ditentukan mengikut nilai TM secara bergilir, terutamanya untuk primer PCR kuantitatif pendarfluor, TM=60℃ atau lebih harus dikawal.
2. kandungan GC
Secara amnya, kandungan G+C dalam jujukan primer ialah 40%~60%, dan kandungan GC dan nilai Tm sepasang primer harus diselaraskan.Jika buku asas mempunyai kecenderungan GC atau AT yang serius, jumlah ekor A, T atau G dan C yang sesuai boleh ditambah pada hujung 5' primer.
3. Suhu penyepuhlindapan
Suhu penyepuhlindapan hendaklah 5 ℃ lebih rendah daripada suhu tidak rantai.Jika bilangan asas primer adalah kecil, suhu penyepuhlindapan boleh ditingkatkan dengan sewajarnya, yang boleh meningkatkan kekhususan PCR.Jika bilangan tapak adalah besar, suhu penyepuhlindapan boleh dikurangkan dengan sewajarnya.Perbezaan suhu penyepuhlindapan antara sepasang primer 4℃ ~ 6℃ tidak akan menjejaskan hasil PCR, tetapi idealnya suhu penyepuhlindapan sepasang primer adalah sama, yang boleh berbeza antara 55℃ ~ 75℃.
4. Elakkan kawasan struktur sekunder templat penguatan
Adalah lebih baik untuk mengelakkan kawasan struktur sekunder templat apabila memilih serpihan yang dikuatkan.Struktur sekunder yang stabil bagi serpihan sasaran boleh diramal dan dianggarkan oleh perisian komputer yang berkaitan, yang berguna untuk pemilihan templat.Keputusan eksperimen menunjukkan bahawa pengembangan selalunya tidak berjaya apabila tenaga bebas (△G) bagi kawasan yang akan dikembangkan adalah kurang daripada 58.6lkJ/mol.
5. Tidak padan dengan DNA sasaran
Apabila jujukan DNA sasaran yang dikuatkan adalah besar, primer boleh mengikat berbilang bahagian DNA sasaran, menyebabkan berbilang jalur muncul dalam hasilnya.Kali ini adalah perlu untuk menggunakan ujian perisian BLAST, tapak web:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Pilih Jajarkan dua jujukan (bl2seq).
Menampal jujukan primer ke zon 1 dan menyasarkan jujukan DNA ke zon 2 boleh ditukar ganti, dan BLAST mengira kemungkinan pelengkap, antisense dan lain-lain, jadi pengguna tidak perlu melihat sama ada kedua-dua rantai adalah rantai deria.Anda juga boleh memasukkan nombor GI jika anda mengetahui nombor GI jujukan dalam pangkalan data, jadi anda tidak perlu menampal sebahagian besar jujukan.Akhir sekali, klik Jajar pada 3 untuk melihat sama ada buku asas mempunyai berbilang tapak homolog dalam DNA sasaran.
6. Terminal primer
Hujung 3' primer ialah tempat sambungan bermula, jadi adalah penting untuk mengelakkan ketidakpadanan daripada bermula di sana.Hujung 3' tidak boleh lebih daripada 3 G atau C berturut-turut, kerana ini akan menyebabkan primer tersalah cetus dalam rantau jujukan pengayaan G+C.Hujung 3' tidak boleh membentuk sebarang struktur sekunder, kecuali dalam tindak balas PCR (AS-PCR) khas, hujung 3' primer tidak boleh tidak sepadan.Sebagai contoh, jika kawasan pengekodan dikuatkan, hujung primer 3 'tidak boleh ditamatkan pada kedudukan ketiga kodon, kerana kedudukan ketiga kodon terdedah kepada degenerasi, yang akan menjejaskan kekhususan dan kecekapan penguatan.Apabila menggunakan primer aneksasi, rujuk jadual penggunaan kodon, perhatikan keutamaan biologi, jangan gunakan primer aneksasi pada hujung 3′, dan gunakan primer kepekatan yang lebih tinggi (1uM-3uM).
7. Struktur sekunder primer
Primer itu sendiri tidak sepatutnya mempunyai urutan pelengkap, jika tidak, primer itu sendiri akan dilipat menjadi struktur jepit rambut, dan struktur sekunder ini akan menjejaskan pengikatan primer dan templat kerana halangan sterik.Jika pertimbangan buatan digunakan, asas pelengkap berterusan primer itu sendiri tidak boleh melebihi 3bp.Seharusnya tiada komplementari antara kedua-dua primer, terutamanya pertindihan pelengkap hujung 3' harus dielakkan untuk mengelakkan pembentukan dimer primer.Secara umum, tidak boleh ada lebih daripada 4 asas berturut-turut homologi atau komplementari antara sepasang primer.
8. Tambah penanda atau lokus
Hujung 5' mempunyai sedikit kesan ke atas kekhususan amplifikasi dan oleh itu boleh diubah suai tanpa menjejaskan kekhususan amplifikasi.Pengubahsuaian akhir primer 5 termasuk: menambah tapak sekatan enzim;Biotin berlabel, pendarfluor, digoxin, Eu3+, dll. Memperkenalkan urutan DNA pengikat protein;Memperkenalkan tapak mutasi, memasukkan dan kehilangan jujukan mutasi dan memperkenalkan jujukan promoter, dsb. Bes tambahan akan lebih kurang menjejaskan kecekapan amplifikasi dan meningkatkan peluang pembentukan dimer primer, tetapi beberapa konsesi mesti dibuat untuk langkah seterusnya.Jujukan tambahan yang tidak wujud pada jujukan sasaran, seperti tapak sekatan dan jujukan promoter, boleh ditambah pada hujung 5' primer tanpa menjejaskan kekhususan.Urutan ini tidak termasuk dalam pengiraan nilai Tm primer, tetapi harus diuji untuk saling melengkapi dan struktur sekunder dalaman.
9. Subklon
Selalunya, PCR hanyalah pengklonan awal, dan kemudian kita perlu mensubklonkan serpihan sasaran ke dalam pelbagai vektor, jadi kita perlu mereka bentuk pangkalan tambahan untuk operasi seterusnya dalam langkah PCR.
Beberapa urutan yang direka untuk subklon diringkaskan di bawah.
Tapak sekatan endonuklease sekatan telah ditambah
Menambah tapak sekatan enzim adalah kaedah yang paling biasa digunakan untuk subkloning produk PCR.Secara amnya, tapak belahan adalah enam tapak, sebagai tambahan kepada 5 'akhir tapak belahan perlu menambah 2 ~ 3 tapak pelindung.Walau bagaimanapun, bilangan bes pelindung yang diperlukan oleh enzim yang berbeza adalah berbeza.Contohnya, SalⅠ tidak memerlukan tapak pelindung, EcoRⅤ memerlukan 1 tapak pelindung, TidakⅠ memerlukan 2 tapak pelindung, dan Hind Ⅲ memerlukan 3 tapak pelindung.
LIC menambah ekor
Nama penuh LIC ialah pengklonan Ligation-Independent, kaedah pengklonan yang dicipta oleh Navogen khusus untuk bahagian vektor pETnya.Pembawa pET yang disediakan melalui kaedah LIC mempunyai hujung melekit satu helai asas 12-15 asas yang tidak saling melengkapi, yang melengkapkan hujung melekit yang sepadan pada serpihan sisipan sasaran.Untuk tujuan penguatan, urutan primer 5′ bagi serpihan yang dimasukkan harus melengkapkan vektor LIC.Aktiviti extranect 3′→5′ polimerase DNA T4 boleh membentuk satu helai hujung melekit pada serpihan yang dimasukkan selepas masa yang singkat.Kerana produk hanya boleh dibentuk daripada penyepuhlindapan bersama serpihan sisipan yang disediakan dan vektor, kaedah ini sangat pantas dan cekap, dan ia diarahkan pengklonan.
Klon TA yang diarahkan menambah ekor
Pengklonan TA tidak dapat menyasarkan serpihan ke dalam vektor, jadi kemudian Invitrogen memperkenalkan vektor yang boleh menyasarkan pengklonan, yang mengandungi empat asas GTGGS yang menonjol pada satu hujung.Oleh itu, dalam reka bentuk primer PCR, urutan pelengkap harus ditambah dengan sewajarnya, supaya serpihan boleh "berorientasikan".
Jika anda kekurangan masa, anda boleh mencuba sintesis langsung, menggabungkan gen dengan vektor, yang kami panggil sintesis gen ET dalam ahli musekular.
D. Kaedah pengklonan In-Fusion
Tiada ligase diperlukan, tiada tindak balas yang lama diperlukan.Selagi urutan pada kedua-dua hujung vektor linear diperkenalkan Dalam reka bentuk primer, maka produk PCR dan vektor linear dimasukkan ke dalam larutan enzim in-fusion yang mengandungi BSA dan diletakkan pada suhu bilik selama setengah jam, transformasi boleh dilakukan.Kaedah ini amat sesuai untuk penukaran volum besar.
10. Gabungkan buku asas
Kadangkala, hanya maklumat jujukan terhad yang diketahui tentang reka bentuk primer.Sebagai contoh, jika hanya urutan asid amino diketahui, primer penggabungan boleh direka bentuk.Primer penggabungan ialah campuran jujukan berbeza yang mewakili semua kemungkinan asas berbeza yang mengekod satu asid amino.Untuk meningkatkan kekhususan, anda boleh merujuk kepada jadual penggunaan kodon untuk mengurangkan aneksasi mengikut keutamaan penggunaan asas bagi organisma yang berbeza.Hypoxanthine boleh dipasangkan dengan semua asas untuk mengurangkan suhu penyepuhlindapan primer.Jangan gunakan tapak lampiran pada hujung 3′ primer kerana penyepuhlindapan 3 tapak terakhir pada hujung 3′ adalah mencukupi untuk memulakan PCR di tapak yang salah.Kepekatan primer yang lebih tinggi (1μM hingga 3μM) digunakan kerana primer dalam banyak campuran aneksasi tidak khusus untuk templat sasaran.
bahan mentah PCRkawalan
1. Kuantiti primer
Kepekatan setiap primer ialah 0.1 ~ 1umol atau 10 ~ 100pmol.Adalah lebih baik untuk menghasilkan hasil yang diperlukan dengan jumlah primer yang paling rendah.Kepekatan primer yang tinggi akan menyebabkan ketidakpadanan dan penguatan bukan khusus, dan meningkatkan peluang untuk membentuk dimer antara primer.
2. Kepekatan primer
Kepekatan primer mempengaruhi kekhususan.Kepekatan primer optimum biasanya antara 0.1 dan 0.5μM.Kepekatan primer yang lebih tinggi membawa kepada penguatan produk tidak spesifik.
3. Suhu penyepuhlindapan primer
Satu lagi parameter penting untuk primer ialah suhu lebur (Tm).Ini ialah suhu apabila 50% daripada primer dan jujukan pelengkap diwakili sebagai molekul DNA beruntai dua.Tm diperlukan untuk menetapkan suhu penyepuhlindapan PCR.Sebaik-baiknya, suhu penyepuhlindapan adalah cukup rendah untuk memastikan penyepuhlindapan berkesan bagi primer dengan urutan sasaran, tetapi cukup tinggi untuk mengurangkan pengikatan tidak spesifik.Suhu penyepuhlindapan yang munasabah dari 55 ℃ hingga 70 ℃.Suhu penyepuhlindapan biasanya ditetapkan 5℃ lebih rendah daripada Tm primer.
Terdapat beberapa formula untuk menetapkan Tm, yang sangat berbeza bergantung pada formula yang digunakan dan jujukan primer.Oleh kerana kebanyakan formula memberikan anggaran nilai Tm, semua suhu penyepuhlindapan hanyalah titik permulaan.Kekhususan boleh dipertingkatkan dengan menganalisis beberapa tindak balas yang secara beransur-ansur meningkatkan suhu penyepuhlindapan.Mulakan di bawah anggaran Tm-5℃, dan secara beransur-ansur meningkatkan suhu penyepuhlindapan dalam kenaikan 2℃.Suhu penyepuhlindapan yang lebih tinggi akan mengurangkan pembentukan dimer primer dan produk tidak khusus.Untuk hasil terbaik, kedua-dua primer harus mempunyai nilai Tm anggaran.Jika perbezaan Tm pasangan primer adalah lebih daripada 5 ℃, primer akan menunjukkan permulaan palsu yang ketara dengan menggunakan suhu penyepuhlindapan yang lebih rendah dalam kitaran.Jika kedua-dua primer Tm berbeza, tetapkan suhu penyepuhlindapan kepada 5℃ lebih rendah daripada Tm terendah.Sebagai alternatif, untuk meningkatkan kekhususan, lima kitaran boleh dilakukan terlebih dahulu pada suhu penyepuhlindapan yang direka untuk Tm yang lebih tinggi, diikuti oleh kitaran yang tinggal pada suhu penyepuhlindapan yang direka untuk Tm yang lebih rendah.Ini membolehkan salinan separa templat destinasi diperoleh dalam keadaan yang ketat.
4. Primer ketulenan dan kestabilan
Ketulenan standard primer tersuai adalah memadai untuk kebanyakan aplikasi PCR.Penyingkiran kumpulan benzoil dan isobutilil dengan penyahgaraman adalah minimum dan oleh itu tidak mengganggu PCR.Sesetengah aplikasi memerlukan penulenan untuk mengalih keluar sebarang jujukan bukan panjang penuh dalam proses sintesis.Urutan terpotong ini berlaku kerana kecekapan kimia sintesis DNA tidak 100%.Ini adalah proses bulat yang menggunakan tindak balas kimia berulang kerana setiap bes ditambah untuk membuat DNA dari 3′ hingga 5′.Anda boleh gagal dalam mana-mana kitaran.Primer yang lebih panjang, terutamanya yang lebih daripada 50 asas, mempunyai sebahagian besar jujukan terpotong dan mungkin memerlukan penulenan.
Hasil primer dipengaruhi oleh kecekapan kimia sintetik dan kaedah penulenan.Syarikat biofarmaseutikal, seperti Cytology dan Shengong, semuanya menggunakan unit OD minimum untuk memastikan jumlah keluaran oligonukleosida.Primer tersuai dihantar dalam bentuk serbuk kering.Adalah lebih baik untuk melarutkan semula primer dalam TE supaya kepekatan akhir ialah 100μM.TE lebih baik daripada air ternyahion kerana pH air selalunya berasid dan akan menyebabkan hidrolisis oligonukleosida.
Kestabilan primer bergantung pada keadaan penyimpanan.Serbuk kering dan primer terlarut hendaklah disimpan pada -20℃.Primer yang dilarutkan dalam TE pada kepekatan lebih daripada 10μM boleh disimpan secara stabil pada -20℃ selama 6 bulan, tetapi hanya boleh disimpan pada suhu bilik (15℃ hingga 30℃) kurang daripada 1 minggu.Primer serbuk kering boleh disimpan pada -20 C selama sekurang-kurangnya 1 tahun dan pada suhu bilik (15 C hingga 30 C) sehingga 2 bulan.
5. Enzim dan kepekatannya
Pada masa ini, polimerase DNA Taq yang digunakan pada asasnya adalah enzim kejuruteraan gen yang disintesis oleh bakteria koliform.Jumlah enzim yang diperlukan untuk memangkinkan tindak balas PCR biasa ialah kira-kira 2.5U (merujuk kepada jumlah isipadu tindak balas 100ul).Jika kepekatan terlalu tinggi, ia boleh membawa kepada penguatan tidak spesifik;jika kepekatan terlalu rendah, jumlah produk sintetik akan berkurangan.
6. Kualiti dan kepekatan dNTP
Kualiti dNTP berkait rapat dengan kepekatan dan kecekapan penguatan PCR.Serbuk dNTP adalah berbutir, dan kebolehubahannya kehilangan aktiviti biologinya jika ia disimpan dengan tidak betul.Larutan dNTP adalah berasid, dan harus digunakan dalam kepekatan tinggi, dengan larutan penimbal 1M NaOH atau 1M Tris.HCL untuk melaraskan PHnya kepada 7.0 ~ 7.5, jumlah kecil sub-pembungkusan, penyimpanan beku pada -20℃.Pencairan beku berganda akan merendahkan dNTP.Dalam tindak balas PCR, dNTP hendaklah 50 ~ 200umol/L.Terutamanya, perhatian harus diberikan kepada kepekatan empat DNTPS harus sama (persediaan tahi lalat yang sama).Jika kepekatan mana-mana satu daripadanya berbeza daripada yang lain (lebih tinggi atau lebih rendah), ketidakpadanan akan berlaku.Kepekatan yang terlalu rendah akan mengurangkan hasil produk PCR.dNTP boleh bergabung dengan Mg2+ dan mengurangkan kepekatan Mg2+ bebas.
7. Templat (gen sasaran) asid nukleik
Jumlah dan tahap penulenan asid nukleik templat adalah salah satu pautan utama untuk kejayaan atau kegagalan PCR.Kaedah penulenan DNA tradisional biasanya menggunakan SDS dan protease K untuk mencerna dan melupuskan spesimen.Fungsi utama SDS ialah: melarutkan lipid dan protein pada membran sel, dengan itu memusnahkan membran sel dengan melarutkan protein membran, dan mengasingkan protein nuklear dalam sel, SDS juga boleh bergabung dengan protein dan mendakan;Protease K boleh menghidrolisis dan mencerna protein, terutamanya histon yang terikat dengan DNA, dan kemudian menggunakan pelarut organik fenol dan kloroform untuk mengekstrak protein dan komponen sel lain, dan menggunakan etanol atau isopropil alkohol untuk mendakan asid nukleik.Asid nukleik yang diekstrak boleh digunakan sebagai templat untuk tindak balas PCR.Untuk spesimen pengesanan klinikal am, kaedah cepat dan mudah boleh digunakan untuk melarutkan sel, patogen lisat, mencerna dan mengeluarkan protein daripada kromosom kepada gen sasaran yang bebas, dan digunakan secara langsung untuk penguatan PCR.Pengekstrakan templat RNA biasanya menggunakan kaedah guanidine isothiocyanate atau protease K untuk menghalang RNase daripada merendahkan RNA.
8. kepekatan Mg2+
Mg2+ mempunyai kesan yang ketara terhadap kekhususan dan hasil penguatan PCR.Dalam tindak balas PCR umum, apabila kepekatan pelbagai dNTP ialah 200umol/L, kepekatan Mg2+ yang sesuai ialah 1.5 ~ 2.0mmol/L.Kepekatan Mg2+ terlalu tinggi, kekhususan tindak balas berkurangan, penguatan tidak spesifik berlaku, kepekatan terlalu rendah akan mengurangkan aktiviti polimerase DNA Taq, mengakibatkan pengurangan produk tindak balas.
Ion magnesium menjejaskan beberapa aspek PCR, seperti aktiviti polimerase DNA, yang menjejaskan hasil;Contoh lain ialah penyepuhlindapan primer, yang menjejaskan kekhususan.dNTP dan templat mengikat kepada ion magnesium, mengurangkan jumlah ion magnesium bebas yang diperlukan untuk aktiviti enzim.Kepekatan ion magnesium optimum berbeza-beza untuk pasangan primer dan templat yang berbeza, tetapi kepekatan permulaan PCR biasa dengan 200μM dNTP ialah 1.5mM (nota: Untuk PCR kuantitatif masa nyata, gunakan larutan ion magnesium 3 hingga 5mM dengan probe pendarfluor).Kepekatan ion magnesium bebas yang lebih tinggi meningkatkan hasil, tetapi juga meningkatkan penguatan tidak spesifik dan mengurangkan kesetiaan.Untuk menentukan kepekatan optimum, titrasi ion magnesium dilakukan dengan kenaikan 0.5mM daripada 1mM hingga 3mM.Untuk mengurangkan pergantungan pada pengoptimuman ion magnesium, polimerase DNA Platinum Taq boleh digunakan.Polimerase DNA Platinum Taq mampu mengekalkan fungsi dalam julat kepekatan ion magnesium yang lebih luas daripada polimerase DNA Taq dan oleh itu memerlukan kurang pengoptimuman.
9. Bahan tambahan penggalak PCr
Pengoptimuman suhu penyepuhlindapan, reka bentuk primer, dan kepekatan ion magnesium adalah mencukupi untuk penguatan yang sangat spesifik bagi kebanyakan templat;walau bagaimanapun, sesetengah templat, termasuk yang mempunyai kandungan GC tinggi, memerlukan langkah tambahan.Aditif yang mempengaruhi suhu lebur DNA menyediakan cara lain untuk meningkatkan kekhususan dan hasil produk.Denaturasi penuh templat diperlukan untuk hasil terbaik.
Di samping itu, struktur sekunder menghalang pengikatan primer dan lanjutan enzim.
Aditif PCR, termasuk formamide, DMSO, gliserin, betaine, dan Penyelesaian Penambah PCRx, meningkatkan penguatan.Mekanisme mereka yang mungkin adalah untuk mengurangkan suhu lebur, dengan itu membantu penyepuhlindapan primer dan membantu pelanjutan polimerase DNA melalui kawasan struktur sekunder.Penyelesaian PCRx mempunyai kelebihan lain.Pengoptimuman ion magnesium minimum diperlukan apabila digunakan dengan polimerase DNA Platinum Taq dan polimerase DNA Platinum Pfx.Oleh itu, teknik Platinum digabungkan dengan bahan tambahan untuk meningkatkan kekhususan sambil mengurangkan pergantungan pendekatan ketiga, pengoptimuman ion magnesium.Untuk hasil terbaik, kepekatan bahan tambahan harus dioptimumkan, terutamanya DMSO, formamide, dan gliserol, yang menghalang polimerase DNA Taq.
10. Permulaan panas
PCR permulaan panas adalah salah satu kaedah terpenting untuk meningkatkan kekhususan PCR selain reka bentuk primer yang baik.Walaupun suhu pemanjangan optimum polimerase DNA Taq ialah 72 ℃, polimerase kekal aktif pada suhu bilik.Oleh itu, produk tidak khusus dihasilkan apabila suhu pegangan lebih rendah daripada suhu penyepuhlindapan semasa penyediaan tindak balas PCR dan pada permulaan kitaran haba.Setelah terbentuk, produk tidak spesifik ini dikuatkan dengan berkesan.PCR permulaan panas amat berkesan apabila tapak yang digunakan untuk reka bentuk primer dihadkan oleh lokasi unsur genetik, seperti mutasi terarah tapak, pengklonan ekspresi, atau pembinaan dan manipulasi unsur genetik yang digunakan untuk kejuruteraan DNA.
Kaedah biasa untuk mengehadkan aktiviti polimerase DNA Taq ialah menyediakan larutan tindak balas PCR pada ais dan meletakkannya di dalam radas PCR yang telah dipanaskan terlebih dahulu.Kaedah ini mudah dan murah, tetapi ia tidak melengkapkan aktiviti enzim dan oleh itu tidak sepenuhnya menghapuskan penguatan produk tidak spesifik.
Penyebuan terma melambatkan sintesis DNA dengan menghalang komponen penting sehingga radas PCR mencapai suhu denaturasi.Kebanyakan kaedah permulaan terma manual, termasuk penambahan tertunda polimerase DNA Taq, adalah menyusahkan, terutamanya untuk aplikasi pemprosesan tinggi.Kaedah penyebuan haba lain menggunakan perisai lilin untuk melampirkan komponen penting, termasuk ion magnesium atau enzim, atau untuk mengasingkan komponen reaktif secara fizikal, seperti templat dan penimbal.Semasa kitaran haba, pelbagai komponen dilepaskan dan dicampur bersama apabila lilin cair.Seperti kaedah permulaan panas manual, kaedah perisai lilin adalah rumit dan terdedah kepada pencemaran dan tidak sesuai untuk aplikasi pemprosesan tinggi.
Platinum DNA polimerase adalah mudah dan cekap untuk PCR permulaan panas automatik.Polimerase DNA Platinum Taq terdiri daripada polimerase DNA Taq rekombinan yang digabungkan dengan antibodi monoklonal terhadap polimerase DNA Taq.Antibodi dirumus oleh PCR untuk menghalang aktiviti enzim semasa memegang suhu yang berpanjangan.Taq DNA polimerase dilepaskan ke dalam tindak balas semasa penebat 94 ℃ langkah denaturasi, memulihkan aktiviti polimerase penuh.Berbeza dengan polimerase DNA Taq yang diubah suai secara kimia untuk permulaan haba, enzim Platinum tidak memerlukan penebat berpanjangan pada 94 ℃ (10 hingga 15 minit) untuk mengaktifkan polimerase.Dengan polimerase DNA PlatinumTaq, 90% aktiviti polimerase DNA Taq telah dipulihkan selepas 2 minit pada 94 ℃.
11. Sarang-PCR
Pusingan penguatan berturut-turut menggunakan primer bersarang boleh meningkatkan kekhususan dan sensitiviti.Pusingan pertama ialah penguatan standard 15 hingga 20 kitaran.Sebilangan kecil produk penguatan awal telah dicairkan 100 hingga 1000 kali dan ditambah kepada pusingan kedua penguatan selama 15 hingga 20 kitaran.Sebagai alternatif, produk yang dikuatkan awal boleh diukur dengan penulenan gel.Primer bersarang digunakan dalam pusingan kedua penguatan, yang boleh mengikat urutan sasaran di dalam primer pertama.Penggunaan PCR bersarang mengurangkan kemungkinan penguatan berbilang tapak sasaran kerana terdapat beberapa urutan sasaran yang melengkapi kedua-dua set primer.Jumlah bilangan kitaran yang sama (30 hingga 40) dengan primer yang sama menguatkan tapak tidak spesifik.PCR bersarang meningkatkan sensitiviti jujukan sasaran terhad (cth, mrnas jarang) dan meningkatkan kekhususan PCRS sukar (cth 5′ RACE).
12. PCR menurun
PCR menurun meningkatkan kekhususan dengan menggunakan keadaan penyepuhlindapan yang ketat untuk beberapa kitaran pertama PCR.Kitaran bermula pada suhu penyepuhlindapan kira-kira 5℃ lebih tinggi daripada anggaran Tm, kemudian setiap kitaran dikurangkan sebanyak 1℃ hingga 2℃ sehingga suhu penyepuhlindapan berada di bawah Tm 5℃.Hanya templat destinasi dengan homologi tertinggi akan dikuatkan.Produk ini terus berkembang dalam kitaran seterusnya, menyesakkan keluar produk tidak spesifik yang dikuatkan.PCR menurun berguna untuk kaedah di mana tahap homologi antara primer dan templat sasaran tidak diketahui, seperti cap jari DNA AFLP.
Kit PCR Berkaitan
Wira 2× PCRTMSistem campuran mempunyai toleransi yang lebih tinggi kepada perencat PCR daripada sistem Campuran PCR biasa, dan boleh mengatasi penguatan PCR pelbagai templat kompleks dengan mudah.Sistem tindak balas yang unik dan Taq Hero berkecekapan tinggi menjadikan tindak balas PCR mempunyai kecekapan penguatan, kekhususan dan kepekaan yang lebih tinggi.
Kecekapan amplifikasi yang lebih tinggi
Ia mempunyai aktiviti polimerase DNA 5'→3' dan aktiviti exonuclease 5'→3', tanpa aktiviti exonuclease 3'→5'.
PCR Masa Nyata Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Penampan yang dioptimumkan khusus dan enzim Taq permulaan panas boleh menghalang penguatan tidak spesifik dan pembentukan dimer primer
Kepekaan tinggi—boleh mengesan salinan templat yang rendah
Kit ini menggunakan reagen transkripsi terbalik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase digabungkan dengan sistem tindak balas yang unik untuk meningkatkan kecekapan amplifikasi dan kekhususan tindak balas dengan berkesan.
Masa siaran: Mei-09-2023
