RNase ialah perkataan sensitif yang ramai pelajar yang sering menjalankan eksperimen pengekstrakan RNA tidak mahu dengar.Bersenjata sepenuhnya, RNA yang akhirnya diekstrak dengan reagen sangat toksik fenol dan kloroform telah terdegradasi.Saya tidak berdamai!!!Hari ini, mari kita lihat asal usul Rnase yang terkenal.

Ribonuclease (RNase), atau RNase, ialah nuklease yang boleh menghidrolisis RNA menjadi molekul kecil.RNase, sebagai protein molekul kecil, adalah luar biasa stabil .Pensterilan wap suhu tinggi dan tekanan tinggi konvensional dan perencat protein tidak boleh menyahaktifkannya sepenuhnya.Kestabilan RNase terutamanya berasal daripada ikatan disulfida dalam struktur.Sebagai contoh, RNase pankreas lembu yang biasa digunakan hanya mempunyai 124 asid amino, tetapi mengandungi 4 ikatan disulfida.Ikatan sulfur dan ikatan disulfida memberikan RNase dengan kestabilan haba yang sangat baik.Di samping itu, rnase mempunyai berat molekul yang agak kecil dan dengan cepat boleh memulihkan konformasi asalnya dalam banyak kes.

Selain sangat stabil,RNases ada di mana-mana di makmal .RNase adalah mekanisme pertahanan biologi.Untuk sel, RNA eksogen selalunya membawa maut.Berbanding dengan DNA eksogen, RNA eksogen selalunya lebih berbahaya.RNA ditranskripsi dan diterjemahkan dengan gembira, jadi hampir semua organisma telah mengembangkan RNases untuk mempertahankan daripada pencerobohan RNA eksogen.Oleh itu, sel bakteria yang ditanam di makmal dan anda yang mengekstrak RNA memancarkan aroma RNase.Cecair badan manusia (air liur, air mata, dsb.) mengandungi sejumlah besar RNase, jadi jangan menangis apabila RNA terdegradasi.Semakin anda menangis, semakin teruk kemerosotan RNA!!Kakak Daiyu tidak sesuai untuk pengekstrakan RNA!

Selain itu, kulit halus anda juga mengandungi banyak RNase, dan penanda, pipet, pintu peti sejuk dan pemegang pintu yang telah disentuh oleh kulit juga mengandungi RNase.

Dengan begitu banyak bertele-tele, mari kita lihat cara menangani RNases.

Perkara pertama yang semua orang fikirkan apabila mengeluarkan RNA ialahDEPC(dietil pirokarbonat).DEPC terutamanya mendenaturasi protein dengan menggabungkan dengan cincin imidazole histidine kumpulan aktif RNase, dengan itu menghalang aktiviti enzim.0.1% DEPC boleh memberi kesan penyingkiran yang lebih baik pada Rnase, tetapi kita perlu memberi perhatian bahawa DEPC adalah karsinogen yang diketahui, jadi perhatian khusus harus diberikan apabila menggunakannya.

Untuk RNase, kita perlu bermula dari dua aspek,yang pertama adalah untuk menghalang aktiviti RNase endogen

Reagen pengekstrakan RNA konvensional seperti guanidine isothiocyanate dan DTT yang terkandung dalam Trizol boleh membuka ikatan disulfida RNase, tetapi masih terdapat beberapa RNases, terutamanya dalam sampel tisu, jadi perhatikan suhu rendah.

1.Segera rendam sampel tisu dalam nitrogen cecair selepas mengeluarkannya, atau dalam larutan pemeliharaan RNA komersial.

2.Selepas mengekstrak RNA sampel sel, tambahkannya ke dalam larutan lisis dan lisiskannya pada kotak ais

3. Sebaik-baiknya gunakan nitrogen cecair untuk mengisar apabila sampel tisu dihomogenkan.Apabila menggunakan homogenizer elektrik tanpa nitrogen cecair, beri perhatian kepada pra-penyejukan penyesuai homogenat sepenuhnya.

Yang kedua ialah DNase eksogen

1.Bersenjata sepenuhnya, pakai kot makmal, pakai topeng, dan pastikan anda memakai sepasang sarung tangan baharu (jangan berjimat cermat!! Harus diingat bahawa Trizol sangat menghakis, dan ia juga sangat kuat melalui sarung tangan, jadi jangan menitis pada tangan anda).

2.Semua tip pipet terpakai, tiub EP, tiub PCR dan peralatan lain mesti dirawat de-RNase.Ia boleh direndam dalam 0.1% DEPC dan kemudian bertekanan di bawah tekanan tinggi.Beri perhatian kepada operasi dalam hud wasap.Tiran tempatan boleh terus membeli bahan habis guna untuk mengeluarkan enzim.

PS: Biar saya beritahu anda kaedah malas.Walaupun suhu tinggi dan tekanan tinggi tidak dapat mengalih keluar RNase sepenuhnya, ia akan mengeluarkan sebahagian besar daripadanya.2 kali suhu tinggi dan tekanan tinggi mempunyai kesan yang baik, dan pengekstrakan RNA mempunyai sedikit kesan.

3.Alkohol boleh menyahtukarkan protein,jadi jadual pengekstrakan RNA boleh disapu dengan alkohol 75%. , dan sarung tangan juga boleh disembur dengan alkohol.

4.Larutan pelarut RNA akhir dan tiub emparan juga harus dirawat de-RNase.Air DEPC ialah larutan pelarut RNA yang biasa digunakan.Mari kita bincangkan tentang kaedah penyediaan air DEPC yang betul (ingat untuk membungkus semula DEPC komersial apabila anda membelinya)

Tambahkan DEPC kepada air ultratulen pada 1:1000, goncang dengan baik, biarkan semalaman pada suhu 37°C, dan sterilkan pada 121°C di bawah suhu tinggi dan tekanan tinggi selama 15 minit.Air DEPC boleh disimpan pada -20°C dalam aliquot 1ml.

Akhir sekali, secara ringkasnya: suhu rendah adalah kuncinya, bahan habis pakai dikendalikan dengan baik, bersenjata lengkap dan kurang bercakap!

Nah, itu sahaja untuk strategi hari ini.Saya berharap anda semua kepekatan dan kesucian RNA yang anda nyatakan.Kedua-dua A260/A280 adalah 2.0!!!

Sudah tentu, jika anda menggunakan akit pengekstrakan RNA operasi suhu bilik, anda mungkin tidak menghadapi masalah di atas.

Operasi pada suhu bilik, tanpa menambah DNase, mengekstrak jumlah RNA daripada sel dalam 11 minit, dan mengekstrak jumlah RNA daripada tisu haiwan atau tumbuhan dalam 30 minit.

Untuk sampel percubaan, sila hubungi:overseas@foregene.com

Produk Berkaitan:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/