RT-qPCR ialah eksperimen asas biologi molekul, dan semua orang mesti biasa dengannya.Ia terutamanya merangkumi tiga langkah: pengekstrakan RNA, transkripsi terbalik ke dalam cDNA, dan PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata.Ia tidak membantu, apa yang sedang berlaku?Berkemungkinan ada masalah denganeksperimen transkripsi terbalik!Walaupun nampaknya percubaan transkripsi terbalik hanya perlu menambah RNA, dNTP, primer dantranskripase terbalikke tiub centrifuge dan gaul rata, tetapi dalam proses operasi sebenar, masih banyak butiran yang perlu diberi perhatian.Mari belajar mengenainya!

Bagaimana untuk menilai kualiti RNA?
Untuk mendapatkan cDNA, kualiti RNA adalah kritikal!Kualiti RNA boleh dikesan terutamanya dari dua aspek:
(1) Integriti RNA:Integriti RNA boleh disahkan oleh elektroforesis gel agarose. Mengambil eukariota sebagai contoh, jumlah RNA yang lengkap mempunyai tiga jalur yang jelas, berat molekul dari besar ke kecil ialah 28S, 18S, dan 5S, dan 28S adalah dua kali lebih terang daripada 18S;jika tiga jalur boleh dilihat, tetapi jenis jalur adalah kabur atau Diffusion bermakna RNA sebahagiannya terdegradasi.Pada masa ini, sila lakukan tindak balas transkripsi terbalik dengan segera dan tingkatkan input templat dengan sewajarnya;jika hanya jalur dengan berat molekul kecil atau tiada jalur boleh dilihat, RNA telah terdegradasi sepenuhnya dan perlu diekstrak semula.Agilent 2100 menunjukkan integriti RNA dengan gambar rajah puncak dan nilai RIN.Jika asid nukleik adalah utuh, garis dasar elektroferogram adalah rata;jika asid nukleik terdegradasi dengan teruk, garis dasar tidak sekata dan lebih banyak puncak degradasi muncul;nilai RIN mencerminkan integriti RNA, dalam julat 0-10, semakin besar nilainya, semakin baik kualiti RNA.Nah, semakin tinggi tahap kesempurnaan.
(2) Kesucian RNA:Nisbah OD260/280 boleh dikesan oleh spektrofotometri UV.Jika nisbah OD260/280 adalah antara 1.9 dan 2.1, ketulenan adalah sangat baik.
DNA genom sisa boleh membawa kepada keputusan kuantitatif yang tidak tepat
Apabila RNA diekstrak, RNA yang kita dapat mungkin bercampur dengan DNA genomik (gDNA) yang belum dibersihkan.Oleh itu, cDNA selepas transkripsi terbalik juga akan bercampur dengangDNA.Semasa di hilirqPCRtindak balas,cDNAdan gDNA boleh dikuatkan secara serentak, menghasilkan nilai CT yang agak kecil, jadi hasilnya mungkin berat sebelah.
Jadi apa yang perlu kita lakukan dalam keadaan ini?Foregenemencadangkan:
(1) Lakukan pembersihan genom pada RNA terbalik, yang boleh dikeluarkan melalui pengekstrakan lajur semasa pengekstrakan RNA;
(2) Rawat RNA yang diekstrak dengan DNaseI , tetapi tamatkannya dengan EDTA;
daripada reagen transkripsi terbalikdengan modul pembersihan genom;

Bagaimana untuk memilih primer untuk transkripsi terbalik?
Primer transkripsi songsang juga mempengaruhi hasil tindak balas transkripsi songsang.Anda boleh memilih primer rawak, Oligo dT atau primer khusus gen untuk transkripsi terbalik mengikut keadaan khusus eksperimen:
(1) Transkrip khusus: primer khusus gen disyorkan;
(2) Transkrip serpihan panjang: Oligo dT/primer khusus gen disyorkan;
(3) Serpihan dalaman transkrip segmen panjang: primer khusus gen/ primer rawak / primer rawak + Oligo dT.Jika percubaan qPCR berikutnya dilakukan, Oligo dT tidak boleh digunakan secara bersendirian, kerana menggunakan Oligo dT sahaja boleh menyebabkan bias akhir 3′, yang membawa kepada keputusan percubaan qPCR yang tidak tepat;
(4) miRNA: Primer gelung batang atau primer ekor boleh digunakan.

Berapa kali cDNA produk transkripsi terbalik harus dicairkan untuk kuantifikasi?
Selepas memperoleh cDNA produk transkripsi terbalik, berapa kali cDNA perlu dicairkan untuk eksperimen qPCR adalah sangat penting.Jika kepekatan cDNA terlalu tinggi atau terlalu rendah, kecekapan amplifikasi mungkin terjejas.Bolehkah kepekatan cDNA diukur, dan bagaimana ia perlu dilakukan?
(1) Kepekatan cDNA produk transkripsi songsang tidak boleh diukur, kerana sebagai tambahan kepada produk cDNA, produk transkripsi songsang juga mengandungi Penimbal sisa transkripsi songsang, transkripase terbalik, primer, dsb., yang akan mengganggu hasil pengukuran kepekatan dan menyebabkan OD260/280, OD260/280, OD260/230 tidak mencerminkan nisbah abnormal cD.Pada masa ini, beberapa rakan akan berkata, kemudian saya akan mengukur kepekatan selepas bersuci;di sini,Foregene ingin mengingatkan bahawa cDNA tidak disyorkan untuk dimurnikan, kerana panjang cDNA yang diperoleh melalui pembalikan adalah berbeza, dan cDNA pendek akan hilang dalam penulenan.
(2) Jadi apa yang perlu dilakukan?Sebelum eksperimen qPCR, kecerunan pencairan cDNA boleh ditentukan melalui pra-eksperimen .Contohnya: gunakan larutan stok cDNA, pencairan 10 kali ganda, dan pencairan 100 kali ganda sebagai templat untuk eksperimen qPCR, dan pilih faktor pencairan dengan nilai CT dalam julat 18-28.

Bagaimanakah miRNA harus ditranskripsikan secara terbalik?
miRNA ialah RNA molekul kecil beruntai tunggal dengan saiz kira-kira 22 nt yang tidak berkod untuk protein.Oleh kerana panjangnya yang pendek, kaedah qPCR konvensional sukar untuk mengukurnya secara langsung, jadi selalunya perlu untuk melanjutkan miRNA;kaedah transkripsi songsang yang biasa digunakan untuk miRNA termasuk kaedah gelung batang dan kaedah tailing.
Kaedah gelung batang adalah untuk memanjangkan miRNA dengan menambahkan primer gelung batang.Kaedah pengesanan ini mempunyai sensitiviti dan kekhususan yang lebih tinggi, tetapi daya pengeluaran pengesanan adalah rendah.Satu transkripsi terbalik hanya boleh mengesan satu miRNA dan rujukan dalaman;kaedah penambahan ekor terdiri daripada dua Ia dilengkapkan dengan tindakan bersama dua enzim, iaitu polimerase PoliA dan transkripase terbalik.Polimerase PolyA bertanggungjawab untuk menambah ekor PolyA pada miRNA untuk meningkatkan panjangnya, dan transkripase terbalik melakukan tindak balas transkripsi terbalik.Kaedah ini mempunyai daya pengesanan yang tinggi dan boleh mengesan berbilang miRNA dan rujukan dalaman dalam satu transkripsi terbalik, tetapi sensitiviti dan kekhususan adalah rendah dalam kaedah gelung batang.