Kekhususan pengesanan
Dalam kebanyakan kes, tujuan reka bentuk primer adalah untuk memaksimumkan kekhususan PCR.Ini ditentukan oleh pengaruh yang lebih kurang boleh diramal dari banyak pembolehubah.Satu pembolehubah penting ialah jujukan pada 3′hujung primer.
Yang penting, ujian PCR yang direka bentuk untuk kekhususan lebih berkemungkinan untuk mengekalkan kecekapan tinggi dalam julat dinamik yang luas, kerana ujian tidak menghasilkan produk penguatan bukan spesifik, dengan itu bersaing dengan reagen PCR atau menghalang tindak balas penguatan utama.
Sudah tentu, dalam beberapa kes, kekhususan bukanlah yang paling penting, sebagai contoh, apabila matlamatnya adalah untuk mengukur berkait rapat tetapi patogen yang berbeza, reka bentuk khas, pengoptimuman dan piawaian pengesahan diperlukan.
Lengkung lebur ialah kaedah standard untuk menilai kekhususan amplikon, sekurang-kurangnya dari segi sama ada untuk menguatkan satu sasaran.Walau bagaimanapun, ia mesti ditekankan bahawa lengkung lebur boleh mengelirukan kerana, sebagai contoh, ia boleh dipengaruhi oleh kesan gabungan primer suboptimum dan kepekatan templat yang rendah.
P5 |Lengkung lebur menunjukkan anjakan Tm yang diperoleh daripada dua pengesanan jumlah berbeza dua DNA sasaran.
A. Pada kepekatan yang lebih tinggi (ad)), tiada dimer primer yang jelas selepas pengukuran qPCR selesai.Apabila kepekatan templat berkurangan kepada 50 salinan (e), produk tidak khusus mula muncul dan menjadi satu-satunya produk pada kepekatan terendah (f).
B. Ujian merekodkan Tms yang sama pada semua kepekatan sasaran, dan tiada dimer primer yang jelas walaupun pada kepekatan terendah (5 salinan).Apabila menggunakan dua kaedah pengesanan ini, tiada produk amplifikasi dikesan dalam NTC.
P5 menunjukkan lengkung pelarutan yang diperoleh dengan sampel di mana templat hadir pada kepekatan yang berbeza.P 5a menunjukkan bahawa pada dua kepekatan terendah, Tms produk penguatan bukan spesifik yang dihasilkan adalah lebih rendah daripada amplikon khusus.
Jelas sekali, kaedah pengesanan ini tidak boleh digunakan dengan pasti untuk mengesan sasaran yang wujud dalam kepekatan rendah.
Menariknya, NTC, iaitu, sampel tanpa DNA sama sekali, tidak merekodkan produk penguatan (tidak khusus), menunjukkan bahawa DNA genomik latar belakang boleh mengambil bahagian dalam penguatan/pempolimeran tidak spesifik.
Kadangkala primer latar belakang dan amplifikasi bukan khusus seperti itu tidak boleh diperbaiki, tetapi selalunya mungkin untuk mereka bentuk kaedah pengesanan yang tidak mempunyai amplifikasi tidak khusus dalam sebarang kepekatan templat dan NTC (P 5b).
Di sini, walaupun merekodkan penguatan kepekatan sasaran dengan Cq 35 akan menghasilkan lengkung pembubaran tertentu.Begitu juga, NTC tidak menunjukkan tanda-tanda penguatan tidak spesifik.Kadangkala, tingkah laku pengesanan mungkin bergantung kepada minuman keras ibu, dan hanya penguatan tidak spesifik dikesan dalam komposisi penimbal tertentu, yang mungkin berkaitan dengan kepekatan Mg2+ yang berbeza.
Kestabilan pengesanan
Pengoptimuman Ta ialah langkah berguna dalam pengesahan empirikal dan proses pengoptimuman pengesanan qPCR.Ia memberikan petunjuk langsung tentang keteguhan set primer dengan menunjukkan suhu (atau julat suhu) yang menghasilkan Cq terendah tanpa menguatkan NTC.
Perbezaan sensitiviti dua hingga empat kali ganda mungkin tidak penting bagi orang yang mempunyai ekspresi mRNA tinggi, tetapi untuk ujian diagnostik, ini mungkin bermakna perbezaan antara keputusan negatif positif dan palsu.
Sifat Ta bagi primer qPCR mungkin sangat berbeza.Sesetengah ujian tidak begitu teguh, dan jika ia tidak dilakukan di bawah nilai Ta optimum primer, ia akan cepat runtuh.
Ini penting kerana pengesanan jenis ini selalunya bermasalah di dunia nyata, dan ketulenan sampel, kepekatan DNA, atau kehadiran DNA lain mungkin tidak optimum.
Selain itu, nombor salinan sasaran mungkin berbeza dalam julat yang luas, dan reagen, perkakas plastik atau instrumen mungkin berbeza daripada yang digunakan semasa menyediakan ujian.
P6|Kecerunan suhu menunjukkan keteguhan pengesanan PCR yang berbeza.
A. Gunakan mastermix Sensifast SYBR Bioline (nombor katalog BIO-98050) untuk melakukan PCR pada cDNA yang disediakan daripada RNA otak manusia.
B. Gunakan instrumen CFX qPCR Bio-Rad untuk merekodkan peta amplifikasi dan lengkung pelarutan apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Graf penguatan dan lengkung lebur ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Graf penguatan dan lengkung pembubaran GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs direkodkan pada suhu penyepuhlindapan berbeza, menunjukkan perbezaan dalam Cq direkodkan di bawah kecerunan suhu 7C.
P 6 menunjukkan keputusan tipikal ujian yang tidak diingini, di mana qPCR dilakukan menggunakan kecerunan Tas antara 59C dan 67C (P 6a), menggunakan primer untuk tiga gen khusus otak manusia.
Ia boleh dilihat daripada graf amplifikasi bahawa primer Opalin adalah jauh daripada ideal kerana julat Ta optimumnya adalah sangat sempit (Rajah 6b), iaitu, Cqs tersebar secara meluas, menyebabkan Cqs menjadi ketara berbanding dengan Cqs Rendah optimumnya.
Kaedah pengesanan ini tidak stabil dan boleh menyebabkan penguatan suboptimum.Oleh itu, pasangan primer ini harus direka bentuk semula.Selain itu, analisis lengkung lebur (inset) menunjukkan bahawa kekhususan kaedah pengesanan ini mungkin juga bermasalah, kerana lengkung lebur setiap Ta adalah berbeza.
Kaedah pengesanan ACSBG1 yang ditunjukkan dalam P 6c adalah lebih teguh daripada kaedah pengesanan Opalin di atas, tetapi ia masih jauh daripada ideal, dan berkemungkinan ia boleh dipertingkatkan.
Walau bagaimanapun, kami menekankan bahawa tidak ada hubungan yang diperlukan antara keteguhan dan kekhususan, kerana lengkung pembubaran yang dihasilkan oleh kaedah pengesanan ini menunjukkan nilai puncak yang sama dalam semua Tas (inset).
Sebaliknya, ujian kekukuhan adalah lebih bertolak ansur, menghasilkan Cq yang serupa dalam julat luas Tas, seperti dalam ujian GFAP yang ditunjukkan dalam P 6d.
Perbezaan dalam Cqs yang diperoleh dalam julat 8 darjah Celsius yang sama adalah kurang daripada 1, dan lengkung pembubaran (inset) mengesahkan ciri pengesanan dalam julat suhu ini.Perlu diingat bahawa Tas yang dikira dan julat Ta sebenar mungkin sangat berbeza.
Terdapat banyak garis panduan yang direka untuk membantu penyelidik mereka bentuk primer yang cekap, yang kebanyakannya berdasarkan peraturan yang telah lama wujud dan banyak perhatian telah diberikan kepada 3′hujung primer.Selalunya disyorkan untuk memasukkan G atau C pada hujung 3' dan dua tapak G atau C (pengapit GC), tetapi tidak lebih daripada dua daripada 5 tapak terakhir.
Dalam amalan, peraturan ini boleh membimbing penyelidik, tetapi ia tidak semestinya betul dalam semua keadaan.
P7 |Hujung 3' primer mempunyai sedikit kesan pada kekhususan atau kecekapan.
A. Kedudukan primer untuk gen HIF-1α (NM_181054.2) manusia.
B. Gunakan Agilent Brilliant III SYBR Green mother liquor (Cat. No. 600882) untuk menguatkan enam item ujian.
C. Graf penguatan dan lengkung lebur direkodkan oleh instrumen qPCR CFX Bio-Rad dan primer 3′end.NTC ditunjukkan dalam warna merah.
D. Cqs rekod setiap item ujian
Sebagai contoh, keputusan dalam P 7 bercanggah dengan peraturan 3′end.Semua reka bentuk pada asasnya menghasilkan hasil yang sama, dengan hanya dua kombinasi primer yang membawa kepada penguatan tidak khusus dalam NTC.
Walau bagaimanapun, kami tidak boleh menyokong kesan klip GC, kerana dalam kes ini, menggunakan A atau T sebagai maksimum 30 tapak tidak mengurangkan kekhususan.
Ujian C, di mana primer F berakhir di GGCC, merekodkan Cq dalam NTC, menunjukkan bahawa seseorang mungkin mahu mengelakkan jujukan ini pada 30-hujung.Kami menekankan bahawa satu-satunya cara untuk menentukan urutan 3′akhir yang terbaik bagi pasangan primer adalah dengan menilai beberapa primer calon secara eksperimen.
Kecekapan penguatan
Yang penting, walaupun pengesanan PCR tidak spesifik tidak boleh menjadi spesifik, kecekapan amplifikasi boleh dilaraskan dan dimaksimumkan dalam pelbagai cara dengan menukar enzim, minuman keras ibu, bahan tambahan dan keadaan berbasikal.
Untuk menilai kecekapan pengesanan PCR, sebaiknya gunakan pencairan bersiri 10 atau 5 kali ganda asid nukleik sasaran, iaitu, "kaedah lengkung standard".
Jika amplikon PCR atau sasaran DNA sintetik digunakan untuk menjana lengkung piawai, pencairan bersiri sasaran ini hendaklah dicampur dengan jumlah DNA latar belakang yang tetap (seperti DNA genomik).
P8 |Keluk pencairan untuk menilai kecekapan PCR.
A. Gunakan primer untuk HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA dan R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC dan mastermix Agilent's Brilliant III SYBR Green (nombor katalog 600882) untuk PCR dan keadaan lengkung lebur.
B. 100 ng RNA ditranskripsi terbalik, dicairkan 2 kali, dan sampel cDNA yang dicairkan secara bersiri dicairkan 5 kali kepada 1 ng DNA genom manusia.Keluk lebur ditunjukkan dalam inset.
C. Reaksi RT, pencairan, dan pencairan bersiri telah diulang untuk sampel cDNA kedua, dan hasilnya adalah serupa.
P 8 menunjukkan dua lengkung standard, menggunakan kaedah pengesanan yang sama pada dua sampel cDNA yang berbeza, hasilnya adalah kecekapan yang sama, kira-kira 100%, dan nilai R2 juga serupa, iaitu, tahap kesesuaian antara data eksperimen dan garis regresi atau Data Darjah lineariti.
Kedua-dua lengkung standard adalah setanding, tetapi tidak betul-betul sama.Jika tujuannya adalah untuk mengukur sasaran dengan tepat, perlu diingatkan bahawa adalah tidak boleh diterima untuk memberikan pengiraan nombor salinan tanpa menjelaskan ketidakpastian
P9 |Ketidakpastian pengukuran yang dikaitkan dengan kuantifikasi menggunakan lengkung piawai.
A. Gunakan primer untuk GAPDH (NM_002046) untuk melaksanakan PCR dan keadaan lengkung lebur.F: ACAGTTGCCATGTAGACC dan R: TAACTGGTTGAGCACAGG dan campuran induk SYBR Sensifast Bioline (nombor katalog BIO-98050).
B. Carta penguatan, lengkung lebur dan lengkung piawai direkodkan dengan instrumen qPCR CFX Bio-Rad.
C. Graf lengkung piawai dan 95% selang keyakinan (CI).
D. Nombor salinan dan selang keyakinan 95% bagi tiga nilai Cq yang diperoleh daripada keluk pencairan.
P 9 menunjukkan bahawa untuk ujian yang dioptimumkan, kebolehubahan yang wujud bagi satu lengkung piawai adalah lebih kurang 2 kali (selang keyakinan 95%, minimum hingga maksimum), yang mungkin merupakan kebolehubahan terkecil yang boleh dijangkakan.
Produk berkaitan:
Masa siaran: Sep-30-2021
