Percubaan RT-qPCR termasuk pengekstrakan RNA dan penilaian kualiti, transkripsi terbalik dan qPCR tiga langkah, setiap langkah mempunyai banyak langkah berjaga-jaga, kami akan memperkenalkan secara terperinci di bawah.

Ⅰ.Penilaian kualiti RNA

Dalam eksperimen RT-qPCR, selepas selesai pengekstrakan RNA, kualiti RNA perlu dinilai, dan percubaan susulan hanya boleh dijalankan selepas ia layak.Kaedah penilaian termasuk spektrofotometer, elektroforesis gel Agilent, analisis Agilent 2100, antaranya pengesanan kaedah spektrofotometer dan gel agarose yang paling biasa digunakan.Perlu diingatkan bahawa kedua-dua kaedah ini perlu digunakan bersama untuk melengkapkan pengesanan dan analisis kepekatan, ketulenan dan integriti RNA, untuk memastikan kualiti RNA.

Kit Pengasingan RNA Berkaitan: 

Kit Pengasingan RNA Jumlah Sel

Jumlah RNA yang sangat disucikan dan berkualiti tinggi boleh diperoleh daripada pelbagai sel kultur dalam 11 minit.

Kit Pengasingan RNA Jumlah Haiwan

Mengekstrak RNA total ketulenan tinggi dan berkualiti tinggi dengan pantas dan cekap daripada pelbagai tisu haiwan.

Spektrofotometer:

Spektrofotometer digunakan terutamanya untuk menentukan kepekatan dan ketulenan RNA, tetapi ia tidak dapat mengesan integriti RNA dan sisa genom.Antaranya, A260/280 dan A260/230 adalah parameter penting untuk pengesanan ketulenan RNA, dan ketulenan RNA boleh dikesan mengikut turun naik nilainya:

1. 1.9< A260/280< 2.1, menunjukkan bahawa ketulenan RNA adalah baik;A260/280<1.9, menunjukkan bahawa mungkin terdapat sisa protein dalam RNA;A260/280>2.1, menunjukkan kemungkinan kemerosotan separa RNA, yang boleh disahkan selanjutnya oleh elektroforesis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, menunjukkan bahawa ketulenan RNA adalah baik;A260/230< 2.0, menunjukkan bahawa mungkin terdapat sisa reagen organik dalam RNA, seperti fenol, etanol atau gula.

Elektroforesis gel agarose:

Ujian elektroforesis gel agarose boleh menganalisis integriti RNA, genom dan sisa protein, tetapi tidak dapat mengukur kepekatan RNA dengan tepat atau mengesan sisa reagen organik.Ambil templat RNA eukariotik sebagai contoh:

1. RNA telah tertakluk kepada elektroforesis gel agarose.Jika terdapat hanya tiga jalur tunggal 28sRNA, 18sRNA dan 5.8sRNA pada peta gel, ia menunjukkan bahawa RNA yang diekstrak adalah utuh.Sekiranya terdapat fenomena penyeretan, ia menunjukkan kemerosotan separa RNA.

2. Jika terdapat satu jalur terang antara lubang gam dan jalur 28sRNA, mungkin terdapat sisa DNA genomik.

3. Jika jalur muncul dalam lubang gam, ia menunjukkan bahawa mungkin terdapat sisa protein dan bahan makromolekul lain.

Ⅱ. Transkripsi terbalik

Selepas pengekstrakan RNA selesai, ia perlu diterbalikkan kepada cDNA untuk eksperimen seterusnya, jadi langkah pembalikan adalah penting.Transkripsi songsang akan diperkenalkan daripada pemilihan transkripase terbalik dan primer:

Pemilihan transkripase terbalik:

Transkripase terbalik biasa termasuk AMV RTase dan MMLV RTase.RNase H AMV RTase mempunyai aktiviti yang kuat, panjang sintesis yang pendek, jumlah sintesis yang rendah dan kestabilan terma yang baik (42 ~ 55 ℃).Aktiviti RNase H MMLV RTase adalah lemah, panjang sintesis adalah panjang, jumlah sintesis adalah tinggi, dan kestabilan haba adalah lemah (37 ~ 42 ℃).

Oleh kerana enzim RNase H mempunyai fungsi merendahkan templat RNA, MMLV dengan aktiviti RNase H yang lemah harus dipilih secara keutamaan semasa transkripsi terbalik, dan selepas kejuruteraan genetik kemudian, kestabilan terma MMLV telah mencapai lonjakan kualitatif.Mengambil ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV untuk transkripsi songsang) sebagai contoh, ia adalah transkripase terbalik baharu yang dinyatakan dalam bakteria kejuruteraan E. coli menggunakan teknologi penggabungan semula genetik.Ia adalah polimerase DNA rekombinan yang mensintesis untaian DNA pelengkap daripada RNA untai tunggal, DNA, atau hibrid RNA:DNA.Ia tidak mempunyai aktiviti RNase H, kestabilan yang kuat, pertalian RNA yang kuat, dan sensitiviti pengesanan yang tinggi.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV untuk transkripsi songsang)

Pemilihan primer:

Umumnya primer RT terbahagi kepada tiga kategori: oligo dT, primer rawak dan primer khusus gen.Pilih primer yang sesuai untuk digunakan mengikut keperluan eksperimen yang berbeza.

1. Jika templat berasal dari eukariotik dan cDNA lewat digunakan untuk penguatan PCR rutin, Oligo (dT) disyorkan;Jika eksperimen seterusnya hanya digunakan untuk qPCR, Oligo (dT) disyorkan untuk dicampur dengan primer rawak untuk meningkatkan kecekapan transkripsi terbalik.

2. Jika templat adalah daripada prokariot, Primer Rawak atau primer khusus gen hendaklah dipilih untuk transkripsi terbalik.

Ⅲ.qPCR

Kuantifikasi pendarfluor terutamanya dihuraikan daripada pemilihan kaedah kuantitatif, prinsip reka bentuk primer, pemilihan ROX, konfigurasi sistem tindak balas dan tetapan keadaan tindak balas, dsb.

Pemilihan kaedah kuantitatif:

Kaedah kuantitatif dibahagikan kepada kaedah kuantitatif relatif dan kaedah kuantitatif mutlak.Kuantifikasi relatif boleh digunakan untuk mengesan kesan kaedah rawatan tertentu terhadap ekspresi gen, mengesan perbezaan ekspresi gen pada masa yang berbeza dan membandingkan perbezaan ekspresi gen dalam tisu yang berbeza.Kuantifikasi mutlak boleh mengesan jumlah asid nukleik dalam virus dan sebagainya.Apabila melakukan eksperimen, kita mesti memilih kaedah kuantitatif yang sesuai mengikut eksperimen kita sendiri.

Prinsip reka bentuk primer:

Reka bentuk primer untuk qPCR secara langsung berkaitan dengan kecekapan amplifikasi dan kekhususan produk.Oleh itu, mereka bentuk primer yang baik dengan betul adalah langkah pertama qPCR yang berjaya.Dalam reka bentuk primer, prinsip berikut harus diberi perhatian apabila memenuhi prinsip reka bentuk primer konvensional:

1. Panjang serpihan sasaran dikawal antara 100 dan 300 bp;

2. Reka bentuk cross-exon untuk mengelakkan pengaruh DNA genomik;

3. Primer yang direka bentuk perlu diuji untuk kecekapan amplifikasi, dan hanya apabila kecekapan amplifikasi mencapai standard (90-110%), ia boleh digunakan untuk eksperimen kuantitatif;

4. Kepekatan primer biasanya dioptimumkan antara 0.1uM dan 1.0uM.

Pemilihan daripadaROX:

Dalam proses tindak balas kuantitatif, ROX boleh melaraskan perbezaan laluan optik, kesilapan pipet atau perbezaan volum yang disebabkan oleh penyejatan dan pemeluwapan secara seragam, meningkatkan kebolehulangan keputusan.Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa pemilihan ROX adalah berkaitan dengan instrumen.Jika instrumen qPCR mempunyai fungsi membetulkan perbezaan antara lubang secara automatik, ia tidak perlu menambah ROX;jika tidak, ia perlu menambah pembetulan ROX.Rakan kongsi kecil dalam membeli reagen mestilah mengikut instrumen yang digunakan untuk memilih ROX yang betul, mengelakkan kesilapan kemudian.

Penyediaan sistem tindak balas:

Isipadu tindak balas 20ul dan 50ul lebih disukai.Perkara-perkara berikut perlu diberi perhatian apabila sistem digubal:

1. Sistem tindak balas perlu disediakan melalui pengudaraan dalam meja kerja ultra-bersih, ddH baharu₂O digunakan untuk setiap eksperimen;

2. Setiap eksperimen perlu menyediakan NTC untuk mengesahkan sama ada terdapat pencemaran dalam sistem, dan setiap pasangan primer perlu melakukan NTC semasa menyediakan sistem;

3. Untuk mengesan sama ada terdapat residu gDNA dalam templat RNA, NRT boleh disediakan untuk setiap sampel untuk pengesanan;

4. Semasa menyediakan sistem, disyorkan untuk melakukan sekurang-kurangnya 3 ulangan teknikal untuk satu sampel;

5. Apabila templat adalah cDNA, disyorkan untuk mencairkan 5-10 kali untuk mengurangkan kesan perencatan sistem transkripsi terbalik pada eksperimen qPCR.Adalah lebih baik untuk meneroka kuantiti templat mengikut kecerunan, supaya nilai CT jatuh antara 20-30;

6. Tentukan bilangan tindak balas yang diperlukan, tingkatkan sebanyak 5-10% berdasarkan bilangan tindak balas, dan kira nombor konfigurasi isipadu;

7, sistem disediakan menggunakan prinsip premix, mencampurkan selepas sentrifugasi dan memastikan tiada buih;

8, Seboleh-bolehnya untuk memilih bahan habis pakai yang menyokong.

Kit RT-qPCR yang berkaitan