Pensterilan hujung pipet dan tiub EP, dsb.

1. Sediakan 0.1% (seperseribu) DEPC (bahan yang sangat toksik) dengan air ternyahion, gunakannya dengan berhati-hati dalam hud wasap, dan simpan pada suhu 4°C dari cahaya;

Air DEPC ialah air tulen yang dirawat dengan DEPC dan disterilkan dengan suhu tinggi dan tekanan tinggi.Diuji untuk bebas daripada RNase, DNase dan proteinase.

2. Masukkan hujung pipet dan tiub EP ke dalam 0.1% DEPC, dan pastikan hujung pipet dan tiub EP diisi dengan 0.1% DEP.

3. Lindungi daripada cahaya, biarkan berdiri, semalaman (12-24j)

4. Kotak yang mengandungi hujung dan tiub EP tidak perlu direndam dalam DEPC.Selepas mengeluarkan air DEPC secara kasar dalam hujung atau tiub EP, bungkus dan bungkusnya.

5. 121 darjah Celsius, 30min

6. 180 darjah Celsius, kering selama beberapa jam (sekurang-kurangnya 3 jam)

Nota: a.Pakai sarung tangan dan topeng lateks semasa mengendalikan DEPC!b, atau tanpa pensterilan DEPC, 130 ℃, autoklaf 90 minit (banyak makmal pensterilan suhu tinggi dua kali)

Pertimbangan pengekstrakan RNA

Dua fenomena utama kegagalan pengasingan RNA tisu

Degradasi RNA dan sisa kekotoran dalam tisu,berkenaan degradasi, mari kita lihat dahulu mengapa RNA yang diekstrak daripada sel kultur tidak mudah terdegradasi.Reagen pengekstrakan RNA sedia ada semuanya mengandungi komponen yang menghalang RNase dengan cepat.Tambah lysate ke sel-sel yang dikultur, dan hanya campurkan, semua sel boleh dicampur dengan teliti dengan lysate, dan sel-sel itu benar-benar lisis.Selepas sel dilisiskan, bahan aktif dalam lisat serta-merta menghalang RNase intraselular, jadi RNA kekal utuh.Maksudnya, kerana sel yang dikultur mudah dan sepenuhnya dihubungi dengan lisat, RNA mereka tidak mudah terdegradasi;sebaliknya, RNA dalam tisu mudah terdegradasi kerana sel-sel dalam tisu tidak mudah menghubungi lysate dengan cepat.kerana sentuhan yang mencukupi.Jadi,dengan mengandaikan terdapat cara untuk mengubah tisu menjadi satu sel sambil menghalang aktiviti RNA, masalah degradasi dapat diselesaikan sepenuhnya.

Pengilangan nitrogen cecair adalah kaedah yang paling berkesan.Walau bagaimanapun, kaedah pengilangan nitrogen cecair sangat menyusahkan, terutamanya apabila bilangan sampel adalah besar.Ini menimbulkan perkara terbaik seterusnya: homogenizer.Thepenghomogenkaedah tidak mempertimbangkan persoalan bagaimana aktiviti RNase dihalang sebelum sel-sel dihubungi dengan lysate, sebaliknya berdoa agar kadar gangguan tisu lebih cepat daripada kadar di mana RNase intraselular merendahkan RN.

Kesan homogenizer elektrik adalah lebih baik,dan kesan homogenizer kaca adalah buruk, tetapi secara umum, kaedah homogenizer tidak dapat menghalang fenomena degradasi.Oleh itu, jika pengekstrakan terdegradasi, homogenizer elektrik asal harus digunakan untuk mengisar dengan nitrogen cecair;homogenizer kaca asal hendaklah ditukar kepada homogenizer elektrik atau terus dikisar dengan nitrogen cecair.Masalahnya hampir 100% boleh dilaksanakan.dapat diselesaikan.

Masalah sisa kekotoran yang menjejaskan eksperimen seterusnya mempunyai punca yang lebih pelbagai daripada degradasi, dan penyelesaiannya juga berbeza.Kesimpulannya,jika terdapat degradasi atau sisa kekotoran dalam tisu, kaedah/reagen pengekstrakan untuk bahan eksperimen tertentu mesti dioptimumkan.Anda tidak perlu menggunakan sampel berharga anda untuk pengoptimuman: anda boleh membeli beberapa haiwan kecil seperti ikan/ayam dari pasaran, mengambil bahagian bahan yang sepadan untuk pengekstrakan RNA, dan bahagian lain untuk pengekstrakan protein – kisar dengan Ekstrak mulut, perut dan usus.

RNA sasaran RNA yang diekstrak digunakan untuk eksperimen susulan yang berbeza, dan keperluan kualitinya adalah berbeza

Pembinaan perpustakaan cDNA memerlukan integriti RNA tanpa sisa perencat tindak balas enzim;Utara memerlukan integriti RNA yang lebih tinggi dan keperluan yang lebih rendah untuk residu perencat tindak balas enzim;RT-PCR tidak memerlukan integriti RNA yang terlalu tinggi,tetapi menghalang tindak balas enzim.Keperluan sisa adalah ketat.Input menentukan output;setiap kali matlamatnya adalah untuk mendapatkan RNA ketulenan tertinggi, ia akan merugikan rakyat dan wang.

Pengumpulan/Penyimpanan Sampel

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Degradasi Selepas sampel meninggalkan badan hidup/atau persekitaran pertumbuhan asal, enzim endogen dalam sampel akan mula merendahkan RNA,dan kadar degradasi adalah berkaitan dengan kandungan enzim endogen dan suhu.Secara tradisinya, hanya terdapat dua cara untuk menghalang sepenuhnya aktiviti enzim endogen: tambah lysate serta-merta dan homogenkan dengan teliti dan cepat;potong kecil dan segera beku dalam nitrogen cecair.Kedua-dua pendekatan memerlukan operasi pantas.Yang terakhir ini sesuai untuk semua sampel, manakala yang pertama hanya sesuai untuk tisu dengan kandungan sel yang rendah dan enzim endogen dan lebih mudah untuk dihomogenkan.Khususnya, tisu tumbuhan, hati, timus, pankreas, limpa, otak, lemak, tisu otot, dll. sebaiknya dibekukan dengan nitrogen cecair sebelum meneruskan.

Pemecahan dan homogenisasi sampel

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Degradasi dan Hasil Pemecahan sampel ialahuntuk homogenisasi menyeluruh, iaitu untuk pelepasan RNA yang lengkap dan lengkap.Sel boleh dihomogenkan terus tanpa dipecahkan.Tisu boleh dihomogenkan hanya selepas dipecahkan.Yis dan bakteria perlu dipecahkan dengan enzim yang sepadan sebelum ia boleh dihomogenkan.Tisu dengan kandungan enzim endogen yang lebih rendah dan penghomogenan yang lebih mudah boleh dihancurkan dan dihomogenkan pada satu masa dalam lysate oleh homogenizer;tisu tumbuhan, hati, timus, pankreas, limpa, otak, lemak, tisu otot dan sampel lain, Mereka sama ada tinggi dalam enzim endogen atau tidak mudah dihomogenkan,jadi gangguan tisu dan homogenisasi mesti dilakukan secara berasingan.Kaedah pemecahan yang paling boleh dipercayai dan paling produktif ialah pengilangan dengan nitrogen cecair, dan kaedah homogenisasi yang paling boleh dipercayai ialah penggunaan homogenizer elektrik.Nota khas tentang pengilangan dengan nitrogen cecair: sampel tidak boleh dicairkan semasa keseluruhan proses pengilangan, kerana enzim endogen lebih berkemungkinan berfungsi apabila dibekukan.

Pilihan lysate

Menjejaskan kemudahan operasi dan faktor sisa kekotoran endogen Larutan lisis yang biasa digunakan hampir boleh menghalang aktiviti RNase.Oleh itu, perkara utama dalam memilih penyelesaian lisis adalah untuk mempertimbangkan dalam kombinasi dengan kaedah penulenan.Terdapat satu pengecualian:sampel dengan kandungan enzim endogen yang tinggi disyorkan untuk menggunakan lisat yang mengandungi fenol untuk meningkatkan keupayaan untuk menyahaktifkan enzim endogen.

Pilihan kaedah pembersihan

Faktor-faktor yang mempengaruhi kekotoran endogen sisa, kelajuan pengekstrakan Untuk sampel bersih seperti sel, keputusan yang memuaskan boleh diperolehi dengan hampir mana-mana kaedah penulenan yang ada.Tetapi bagi banyak sampel lain, terutamanya yang mempunyai tahap kekotoran yang tinggi seperti tumbuhan, hati, bakteria, dll., memilih kaedah penulenan yang sesuai adalah penting.Kaedah penulenan emparan lajur mempunyai kelajuan pengekstrakan yang cepat dan berkesan boleh membuang kekotoran yang menjejaskan tindak balas enzimatik RNA yang berikutnya, tetapi ia mahal (Foregene boleh menawarkan kit kos efektif, butiran lanjut klikdi sini);menggunakan kaedah penulenan yang ekonomik dan klasik, seperti pemendakan LiCl, juga boleh memperoleh hasil yang memuaskan, tetapi masa operasi adalah panjang..

"Tiga Disiplin dan Lapan Perhatian" untuk Pengekstrakan RNA

Disiplin 1:Hentikan pencemaran enzim eksogen.

Nota 1:Pakai topeng dan sarung tangan dengan ketat.

Nota 2:Tiub emparan, kepala hujung, batang pipet, tangki elektroforesis, dan bangku eksperimen yang terlibat dalam eksperimen hendaklah dilupuskan dengan teliti.

Nota 3:Reagen/penyelesaian yang terlibat dalam eksperimen, terutamanya air, mestilah bebas RNase.

Disiplin 2:Menyekat aktiviti enzim endogen

Nota 4:Pilih kaedah homogenisasi yang sesuai.

Nota 5:Pilih lysate yang sesuai.

Nota 6:Kawal jumlah permulaan sampel.

Disiplin 3:Jelaskan tujuan pengekstrakan anda

Nota 7:Dengan mana-mana sistem lisat menghampiri jumlah permulaan maksimum sampel, kadar kejayaan pengekstrakan menurun dengan mendadak.

Nota 8:Satu-satunya kriteria ekonomi untuk pengekstrakan RNA yang berjaya ialah kejayaan dalam eksperimen seterusnya, bukan hasil.

10 Punca Teratas Pencemaran RNase

1. Jari adalah sumber pertama enzim eksogen, jadi sarung tangan mesti dipakai dan diganti dengan kerap.Di samping itu, topeng juga mesti dipakai, kerana pernafasan juga merupakan sumber enzim yang penting.Manfaat tambahan memakai topeng sarung tangan adalah untuk melindungi penguji.

2. Petua pipet, tiub emparan, pipet – RNase tidak boleh dinyahaktifkan dengan pensterilan sahaja, jadi hujung pipet dan tiub emparan hendaklah dirawat dengan DEPC, walaupun ia ditandakan sebagai DEPC dirawat.Sebaik-baiknya gunakan pipet tujuan khas, lap dengan kapas alkohol 75% sebelum digunakan, terutamanya batang;sebagai tambahan, pastikan anda tidak menggunakan penanggal kepala.

3. Air/penampan mestilah bebas daripada pencemaran RNase.

4. Sekurang-kurangnya meja ujian hendaklah dilap bersih dengan 75% bebola kapas alkohol.

5. RNase Endogen Semua tisu mengandungi enzim endogen, jadi pembekuan cepat tisu dengan nitrogen cecair adalah cara terbaik untuk mengurangkan degradasi.Kaedah penyimpanan/pengisaran nitrogen cecair sememangnya menyusahkan, tetapi ia adalah satu-satunya cara untuk tisu dengan tahap enzim endogen yang tinggi.

6. Sampel RNA Produk pengekstrakan RNA mungkin mengandungi kesan pencemaran RNase.

7. Pengekstrakan plasmid Pengekstrakan plasmid sering menggunakan Rnase untuk merendahkan RNA, dan baki Rnase harus dicerna dengan Proteinase K dan diekstrak oleh PCI.

8. Penyimpanan RNA Walaupun ia disimpan pada suhu rendah, jumlah surih RNase akan menyebabkan kemerosotan RNA.Penyelesaian terbaik untuk pemeliharaan RNA jangka panjang ialah penggantungan garam/alkohol, kerana alkohol menghalang semua aktiviti enzimatik pada suhu rendah.

9. Apabila kation (Ca, Mg) mengandungi ion ini, pemanasan pada suhu 80C selama 5 minit akan menyebabkan RNA terbelah, jadi jika RNA perlu dipanaskan, larutan pengawetan perlu mengandungi agen pengkelat (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).

10. Enzim yang digunakan dalam eksperimen seterusnya mungkin tercemar oleh RNase.

10 Petua untuk Pengekstrakan RNA

1: Cegah aktiviti RNase dengan cepat.Sampel dibekukan dengan cepat selepas pengumpulan, dan RNase dinyahaktifkan oleh operasi pantas semasa lisis.

2: Pilih kaedah pengekstrakan yang sesuai untuk tisu dengan kandungan ribozim yang tinggi, dan tisu adipos adalah yang terbaik untuk menggunakan kaedah yang mengandungi fenol.

3: Kualiti ramalan memerlukan Utara, pembinaan perpustakaan cDNA memerlukan integriti tinggi, dan RT-PCR dan RPA (ujian perlindungan Ribonuclease) tidak memerlukan integriti tinggi.RT-PCR memerlukan ketulenan tinggi (sisa perencat enzim).

4: Penghomogenan menyeluruh adalah kunci untuk meningkatkan hasil dan mengurangkan degradasi.

5: Semak integriti pengesanan elektroforesis RNA, 28S: 18S = 2: 1 adalah tanda lengkap, 1: 1 juga boleh diterima untuk kebanyakan eksperimen.

6: Penyingkiran DNA untuk RT-PCR, analisis tatasusunan Sebaik-baiknya gunakan Dnase I untuk membuang DNA.

7: Kurangkan pencemaran enzim eksogen - enzim tidak boleh diimport dari luar.

8: Apabila menumpukan asid nukleik berkepekatan rendah, reagen kerpasan bersama perlu ditambah.Tetapi untuk mengelakkan co-precipitant yang mengandungi enzim dan pencemaran DNA.

9: Larutkan RNA dengan teliti, jika perlu, panaskan pada suhu 65C selama 5 minit.

kaedah penyimpanan yang sesuai

Ia boleh disimpan pada –20C untuk masa yang singkat, dan pada –80C untuk masa yang lama.Langkah pertama dalam meningkatkan hasil RNA adalah untuk menyedari bahawa kandungan RNA sampel yang berbeza sangat berbeza.Kelimpahan tinggi (2-4ug/mg) seperti hati, pankreas, jantung, kelimpahan sederhana (0.05-2ug/mg) seperti otak, embrio, buah pinggang, paru-paru, timus, ovari, kelimpahan rendah (<0.05ug/mg) mg) seperti pundi kencing, tulang, lemak.

1: Lyse sel untuk melepaskan RN - jika RNA tidak dikeluarkan, hasil akan berkurangan.Penghomogenan elektrik berfungsi lebih baik daripada kaedah penghomogenan lain, tetapi mungkin juga perlu digabungkan dengan kaedah lain, seperti penumbuk nitrogen cecair, pencernaan enzimatik (Lysozyme/Lyticase)

2: Pengoptimuman kaedah pengekstrakan.Masalah terbesar dengan kaedah berasaskan fenol ialah stratifikasi yang tidak lengkap dan kehilangan separa RNA (supernatan tidak boleh dikeluarkan sepenuhnya).Stratifikasi yang tidak lengkap adalah disebabkan oleh kandungan asid nukleik dan protein yang tinggi, yang boleh diselesaikan dengan meningkatkan jumlah lysate yang digunakan atau mengurangkan jumlah sampel.Satu langkah pengekstrakan kloroform telah ditambahkan pada tisu adiposa.Kehilangan RNA boleh dikurangkan dengan mengepam balik atau dengan mengeluarkan lapisan organik diikuti dengan sentrifugasi.Masalah terbesar dengan kaedah berasaskan sentrifugasi lajur ialah sampel berlebihan.

Petua Pengekstrakan Klasik

1. Penulenan fenol: Tambahkan isipadu yang sama 1:1 Fenol/Kloroform dan gaul kuat-kuat selama 1-2 minit.Sentrifuge pada kelajuan tinggi selama 2 minit.Keluarkan supernatan (80-90%) dengan berhati-hati.Jangan sekali-kali sampai ke lapisan tengah.Isipadu yang sama bagi larutan tindak balas boleh ditambah kepada Fenol/Kloroform dan supernatan dikeluarkan.Kedua-dua supernatan boleh dicampur bersama untuk pemendakan asid nukleik untuk meningkatkan hasil.Jangan terlalu lembut semasa mengadun, dan jangan cuba mengeluarkan semua supernatan.

2. Mencuci dengan 70-80% etanol: Semasa mencuci, asid nukleik mesti digantung untuk memastikan sisa garam dihanyutkan.Pada masa yang sama, sejurus selepas menuang etanol, sentrifuge pada kelajuan tinggi selama beberapa saat, dan kemudian keluarkan sisa etanol dengan pipet.Larutkan selepas berdiri pada suhu bilik selama 5-10 minit.

11. Pengekstrakan organisasi khas

1. Tisu berserabut: Kunci kepada pengekstrakan RNA daripada tisu berserabut seperti jantung/otot rangka adalah untuk mengganggu sepenuhnya tisu tersebut.Tisu ini mempunyai ketumpatan sel yang rendah, jadi jumlah RNA per unit berat tisu adalah rendah, dan sebaiknya gunakan sebanyak mungkin jumlah permulaan.Pastikan untuk mengisar tisu dengan teliti dalam keadaan beku.

2. Tisu dengan kandungan protein/lemak yang tinggi: kandungan lemak otak/sayur adalah tinggi.Selepas pengekstrakan PCI, supernatan mengandungi flokul putih.Supernatan mesti diekstrak semula dengan kloroform.

3. Tisu dengan kandungan asid nukleik/ribozim yang tinggi: limpa/timus mempunyai kandungan asid nukleik dan ribozim yang tinggi.Mengisar tisu di bawah keadaan beku diikuti dengan penghomogenan pantas boleh menyahaktifkan ribozim dengan berkesan.Walau bagaimanapun, jika lisat terlalu likat (disebabkan kandungan asid nukleik yang tinggi), pengekstrakan PCI tidak akan dapat berstrata dengan berkesan;menambahkan lebih banyak lisat boleh menyelesaikan masalah ini.Pengekstrakan PCI berbilang boleh mengeluarkan lebih banyak sisa DNA.Jika mendakan putih terbentuk serta-merta selepas menambah alkohol, ia menunjukkan pencemaran DNA.Pengekstrakan semula dengan PCI berasid selepas pembubaran boleh menghilangkan pencemaran DNA.

4. Tisu tumbuhan: Tisu tumbuhan adalah lebih kompleks daripada tisu haiwan.Secara amnya, tumbuhan dikisar di bawah keadaan nitrogen cecair, jadi degradasi RNA oleh enzim endogen adalah jarang berlaku.Jika masalah degradasi tidak diselesaikan, ia hampir pasti disebabkan oleh kekotoran yang terkandung dalam sampel.Kekotoran yang terkandung dalam banyak tumbuhan akan membawa kepada sisa, dan sebab sisa selalunya kerana kekotoran ini mempunyai beberapa persamaan dengan RNA: anda mendakan dan saya memendakan, dan anda menjerap dan saya menjerap.Ciri-ciri ini menentukan bahawa ia adalah perencat enzim yang sangat kuat.

Pada masa ini, reagen pengekstrakan RNA komersial boleh disesuaikan dengan hampir semua tisu haiwan dengan pelarasan kecil, tetapi terdapat beberapa reagen pengekstrakan RNA komersial yang boleh sesuai untuk kebanyakan tisu tumbuhan.Nasib baik, Foregene boleh menyediakan istimewakit pengekstrakan RNA tumbuhan, kita adaKit Pengasingan RNA Jumlah Tumbuhan, Kit Pengasingan RNA Jumlah Tumbuhan Plus.Yang terakhir ini direka khas untuk tumbuhan dengan kandungan polisakarida dan polifenol yang tinggi.Untuk pengekstrakan RNA, maklum balas daripada pengguna makmal amat baik.

12. Kesan pembekuan dan pencairan sampel Sampel beku mungkin lebih besar, dan ia perlu dipotong sebelum digunakan untuk pengekstrakan RNA.Sampel cenderung cair (mungkin sebahagiannya) semasa pemotongan.Sampel beku mungkin perlu ditimbang sebelum pengekstrakan RNA, dan pencairan pasti akan berlaku semasa proses ini.Kadangkala, pencairan sampel juga berlaku semasa proses pengilangan nitrogen cecair;atau sampel beku ditambah terus kepada lysate tanpa pengilangan nitrogen cecair, dan pencairan pasti akan berlaku sebelum homogenisasi lengkap.Eksperimen telah menunjukkan bahawa tisu beku lebih terdedah kepada kemerosotan RNA semasa pencairan daripada tisu segar.Sebab yang mungkin: Proses pencairan beku mengganggu struktur dalam sel, menjadikannya lebih mudah bagi enzim endogen untuk bersentuhan langsung dengan RNA.

13. Penghakiman kualiti RNA Biasanya, elektroforesis digunakan untuk menilai integriti RNA, dan A260/A280 digunakan untuk menilai ketulenan RNA.Secara teorinya, RNA utuh mempunyai nisbah 28S:18S = 2.7:1, dan kebanyakan data menekankan nisbah 28S:18S = 2:1.Hakikatnya ialah hampir tiada RNA yang diekstrak daripada sampel selain daripada sel berada dalam nisbah 2:1 (ini diperoleh menggunakan Agilent Bioanalyzer).

Keputusan elektroforesis RNA dipengaruhi oleh banyak faktor, termasuk struktur sekunder, keadaan elektroforesis, beban sampel, tahap ketepuan oleh EB, dll. Gunakan elektroforesis asli untuk mengesan RNA dan gunakan Penanda DNA sebagai kawalan.Jika 28S pada 2kb dan 18S pada 0.9kb adalah jelas, dan 28S: 18S > 1, integriti boleh memenuhi keperluan kebanyakan percubaan berikutnya.

A260/A280 adalah penunjuk yang telah menyebabkan banyak kekeliruan.Pertama sekali, adalah perlu untuk menjelaskan maksud asal penunjuk ini untuk asid nukleik: RNA tulen, A260/280 = kira-kira 2.0.RNA tulen ialah 'sebab' dan A260/A280 = 2 ialah 'kesan'.Kini semua orang menggunakan A260/A280 sebagai 'sebab', memikirkan bahawa "jika A260/A280 = 2, maka RNA adalah tulen", yang secara semula jadi membawa kepada kekeliruan.

Jika anda berminat, anda boleh menambah sedikit reagen yang sering digunakan dalam pengekstrakan, seperti fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, dll., pada sampel RNA anda, dan kemudian mengukur nisbah A260/A280.Realitinya ialah banyak reagen yang digunakan untuk pengekstrakan RNA, serta banyak kekotoran dalam sampel, menyerap sekitar A260 dan A280, yang menjejaskan A260/A280.

Pendekatan yang paling instruktif pada masa ini ialah mengimbas sampel RNA dalam julat 200-300 nm.Lengkung RNA tulen mempunyai ciri-ciri berikut: lengkungnya licin, A230 dan A260 ialah dua titik infleksi, A300 menghampiri 0, A260/A280 = sekitar 2.0, dan A260/A230 = sekitar 2.0.Jika data imbasan tidak tersedia, nisbah A260/A230 juga mesti ditentukan, kerana nisbah ini lebih sensitif kepada pemindahan semua kekotoran yang menjejaskan tindak balas enzim.Ambil kira julat linear peranti (0.1–0.5 untuk A260).

Terdapat dua fenomena lain yang berguna: nisbah akan menjadi kira-kira 0.3 lebih rendah apabila A260/A280 diukur dalam air;manakala nisbah yang diukur dalam 10 mM EDTA adalah kira-kira 0.2 lebih tinggi daripada yang diukur dalam 1 mM EDTA.

Produk Berkaitan:

Kit Pengasingan RNA Jumlah Loji China Pengeluar dan Pembekal |Foregene (foreivd.com)

Siri pengasingan RNA Pembekal dan Kilang |Pengeluar siri pengasingan RNA China (foreivd.com)

Siri pengasingan RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)