Kami telah berpengalaman pengilang.Memenangi majoriti dalam pensijilan penting pasarannya untuk Diskaun Besar China High Sensitiviti One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kualiti adalah kehidupan kilang, Fokus pada permintaan pelanggan adalah sumber kelangsungan hidup dan pembangunan syarikat, Kami mematuhi kejujuran dan sikap bekerja dengan niat baik, menantikan kedatangan anda!
Kami telah berpengalaman pengilang.Memenangi majoriti dalam pensijilan penting pasarannya untukChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Syarikat kami menjanjikan: harga yang berpatutan, masa pengeluaran yang singkat dan perkhidmatan selepas jualan yang memuaskan, kami juga mengalu-alukan anda untuk melawat kilang kami pada bila-bila masa yang anda mahukan.Semoga sekarang kita mempunyai perniagaan yang menyenangkan dan jangka panjang bersama-sama!!!

Penerangan

Kit ini menggunakan sistem penimbal lisis unik yang boleh melepaskan RNA dengan cepat daripada sampel sel berbudaya untuk tindak balas RT-qPCR, dengan itu menghapuskan proses penulenan RNA yang memakan masa dan susah payah.Templat RNA boleh diperolehi dalam masa 7 minit sahaja.Reagen 5×Direct RT Mix dan 2×Direct qPCR Mix-SYBR yang disediakan oleh kit boleh mendapatkan keputusan PCR kuantitatif masa nyata dengan cepat dan berkesan.

5×Direct RT Mix dan 2×Direct qPCR Mix-SYBR mempunyai toleransi perencat yang kuat, dan lisat sampel boleh digunakan sebagai templat untuk RT-qPCR secara langsung.Kit ini mengandungi RNA unik pertalian tinggi Foregene reverse transcriptase, dan Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, penimbal tindak balas, pengoptimum PCR dan penstabil.

Spesifikasi

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Komponen kit

Ciri&kelebihan

■ Mudah dan berkesan : dengan teknologi Cell Direct RT, sampel RNA boleh diperolehi dalam masa 7 minit sahaja.

■ Permintaan sampel adalah kecil, serendah 10 sel boleh diuji.

■ Daya tampung yang tinggi: ia boleh mengesan RNA dengan cepat dalam sel yang dikultur dalam plat 384, 96, 24, 12, 6-telaga.

■ Pemadam DNA boleh membuang genom yang dikeluarkan dengan cepat, mengurangkan kesan ke atas keputusan eksperimen seterusnya.

■ Sistem RT dan qPCR yang dioptimumkan menjadikan transkripsi terbalik RT-PCR dua langkah lebih cekap dan PCR lebih spesifik, dan lebih tahan terhadap perencat tindak balas RT-qPCR.

Aplikasi kit

Skop penggunaan: sel kultur.

- RNA yang dikeluarkan oleh lisis sampel: hanya terpakai pada templat RT-qPCR kit ini.

- Kit boleh digunakan untuk tujuan berikut: analisis ekspresi gen, pengesahan kesan pembungkaman gen pengantara siRNA, pemeriksaan dadah, dsb.

Gambar rajah

Penyimpanan dan Jangka hayat

Bahagian I kit ini hendaklah disimpan pada suhu 4 ℃;Bahagian II hendaklah disimpan pada -20℃.

Foregene Protease Plus II hendaklah disimpan pada 4 ℃, jangan beku pada -20 ℃.

Reagen 2×Direct qPCR Mix-SYBR hendaklah disimpan pada -20℃ dalam gelap;jika digunakan dengan kerap, ia juga boleh disimpan pada suhu 4 ℃ untuk simpanan jangka pendek (habis dalam masa 10 hari). Kami telah berpengalaman pengeluar.Memenangi majoriti dalam pensijilan penting pasarannya untuk Diskaun Besar China High Sensitiviti One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Kualiti adalah kehidupan kilang, Fokus pada permintaan pelanggan adalah sumber kelangsungan dan pembangunan syarikat, Kami mematuhi sikap kerja yang jujur ​​dan ikhlas, menanti kedatangan anda!
Diskaun besarChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Syarikat kami menjanjikan: harga berpatutan, masa pengeluaran yang singkat dan perkhidmatan selepas jualan yang memuaskan, kami juga mengalu-alukan anda untuk melawat kilang kami pada bila-bila masa yang anda mahukan.Semoga sekarang kita mempunyai perniagaan yang menyenangkan dan jangka panjang bersama-sama!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Untuk RT-qPCR langsung sel menggunakan ≤ 1000,000 sel

Pengenalan produk

Produk ini menggunakan sistem penimbal lisis yang unik untuk melepaskan RNA dengan cepat daripada sampel sel kultur untuk tindak balas RT-qPCR, menghapuskan proses penulenan RNA yang memakan masa dan susah payah, dan hanya 7 minit untuk mendapatkan templat RNA yang diperlukan, dengan 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman yang disediakan oleh kit boleh mendapatkan hasil kuantitatif PCR masa nyata dengan cepat dan cekap.

5× Direct RT Mix dan 2× Direct qPCR Mix-Taqman mempunyai toleransi perencat yang kuat dan boleh melakukan pembalikan yang cekap dan amplifikasi khusus menggunakan lysate sampel untuk diukur sebagai templat.Reagen mengandungi Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Penampan Reaksi, Pengoptimum PCR dan Penstabil, yang boleh digunakan dengan penimbal lisis untuk mengesan sampel dengan cepat dan mudah, serta mempunyai ciri-ciri kepekaan, kekhususan dan kestabilan yang tinggi.

Ciri-ciri Produk

Teknologi Cell Direct RT yang ringkas dan berkesan yang mengambil masa seawal 7 minit untuk mendapatkan sampel RNA.

Keperluan sampel adalah kecil, dan sekurang-kurangnya 10 sel kultur boleh digunakan untuk percubaan.

Daya tampung yang tinggi untuk pemerolehan RNA pantas sel kultur seperti plat 384, 96, 24, 12 dan 6 telaga.

Pemadam DNA mampu membuang genom yang dikeluarkan dengan cepat, mengurangkan kesan ke atas keputusan eksperimen seterusnya.

Sistem RT dan qPCR yang dioptimumkan membolehkan RT-PCR dua langkah dengan transkripsi terbalik yang lebih cekap, kekhususan dan toleransi perencat tindak balas RT-qPCR yang lebih kuat.

Aplikasi kit

Skop penggunaan: Sel kultur.

RNA ditafsirkan lisis sampel: digunakan hanya sebagai templat RT-qPCR dua langkah.

Kit boleh digunakan untuk tujuan berikut: analisis ekspresi pengawalseliaan gen, ujian alel, pemeriksaan dadah, dsb.

Had kit

Serpihan diperkuat ≤ 300 bp.

Kit digunakan untuk mengkultur sel baru.

Kawalan kualiti produk

Menurut Sistem Pengurusan Kualiti Menyeluruh FOREGENE, setiap kumpulan kit siri Cell Direct RT-qPCR diuji dengan teliti beberapa kali untuk memastikan kebolehpercayaan dan kestabilan kualiti setiap kumpulan kit.

Kandungan kit

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman boleh dibeli secara berasingan, butiran disediakan di Lampiran 1 (MUKA SURAT 13).

Keadaan penyimpanan

1. Syarat Penghantaran

Seluruh proses pengangkutan kotak pek ais suhu rendah, untuk memastikan kit berada dalam keadaan <4 °C.

2. Keadaan penyimpanan

Simpan bahagian I pada suhu 4°C dan Bahagian II pada -20°C.

Foregene Protease Plus II hendaklah disimpan pada suhu 4°C, bukan beku pada -20°C.

Reagen 2× Direct qPCR Mix-Taqman disimpan pada -20°C, atau pada 4°C untuk kegunaan jangka pendek jika digunakan dengan kerap (dalam masa 10 hari).

Maklumat komponen kit

Penampan CL: Menyediakan persekitaran yang diperlukan untuk tindak balas lisis sel.

Penampan ST: Menamatkan bahan aktif dalam lisat untuk mengelakkan kesan pada RT berikutnya.

Pemadam DNA: Penghapus DNA, kesan penyingkiran genom pada eksperimen seterusnya.

5× Direct RT Mix: Mengandungi pertalian RNA tinggi Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTP, penstabil, penambah, pengoptimum dan primer transkripsi terbalik untuk penjajaran optimum (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Dalam konteks penimbal lisis, sel-sel dilisiskan untuk membebaskan asid nukleik.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Reagen ini mengandungi Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, penimbal tindak balas, pengoptimum PCR dan penstabil.

Pewarna Rujukan 20× ROX: Biasanya digunakan pada instrumen penguatan PCR Masa Nyata ABI, Stratagene dan syarikat lain, ia digunakan untuk melaraskan perbezaan antara tiub dan tiub PCR yang disebabkan oleh ralat dos PCR.Kepekatan Pewarna Rujukan 20× ROX yang diperlukan untuk instrumen berbeza adalah berbeza, dan pengguna boleh menambahnya mengikut kepekatan instrumen yang disyorkan.

ddH Tanpa RNase₂O: Air ultra tulen steril bebas RNase untuk tindak balas RT-qPCR dua langkah.

Langkah berjaga-berjaga:(Pastikan anda membaca langkah berjaga-jaga dengan teliti sebelum menggunakan kit)

Beri perhatian kepada kaedah operasi eksperimen untuk mengelakkan pencemaran silang antara sampel.

Beri perhatian kepada kebersihan persekitaran dan peralatan eksperimen untuk mengelakkan pencemaran RNase dan degradasi RNA.

Ambil sampel sel yang segar atau yang dipelihara dengan baik dan jangan sekali-kali menggunakan sampel sel yang dicairkan beku berulang kali.

5× Campuran qPCR Langsung,2× Campuran qPCR Langsung-Taqman harus mengelakkan pencairan beku berulang, jika tidak, ia akan menjejaskan transkripsi terbalik dan kecekapan PCR.

Prepacatuansebelum inioperasi

Pastikan anda membaca arahan dengan teliti sebelum menggunakan kit ini.Kit RT-qPCR Cell Direct adalah ringkas, mudah dan pantas untuk dikendalikan, dan arahan memberikan maklumat lengkap tentang keseluruhan kit dan cara menggunakannya dengan betul.Sila sediakan bahan dan peralatan eksperimen yang diperlukan sebelum digunakan.

Bahan dan peralatan eksperimen

◆ Sel kultur.

◆ 1.5 ml atau 2 ml, tiub emparan Bebas RNase/DNase, hujung Bebas RNase/DNase, 0.2 ml tiub qPCR steril.

◆ mesin qPCR, pipet, emparan atas meja (≥13,400×g) (bergantung kepada keperluan eksperimen), dsb.

Keselamatan

◆ Produk ini adalah untuk tujuan penyelidikan saintifik sahaja, sila jangan gunakan untuk tujuan farmaseutikal, klinikal, makanan dan kosmetik.

◆ Apabila menggunakan bahan kimia, pakai pakaian makmal yang sesuai, sarung tangan, cermin mata pelindung, dsb.

Operasipanduan

Sistem Lisis Sel, sistem RT dan pek tambahan penyelesaian tindak balas qPCR boleh dibeli secara berasingan, untuk butiran dalam Lampiran 1 (MUKA SURAT 13).

Panduan operasi

A: Contoh pelepasan RNA

1.Sel telah diprarawat: Basuh plat kultur sel dengan PBS sejuk, kemudian lisiskan sel (10-10⁶), 10⁶ daripada jumlah sel, disyorkan Foregene the Cell dan Kit Pengasingan RNA Jumlah (DE-03111) atau Kit Pengasingan RNA Jumlah Haiwan (DE-03011) untuk pengekstrakan dan penulenan RNA.

1.1.Sel melekat (24-plat telaga sebagai contoh)

1.1.1.Tentukan bilangan sel dalam setiap telaga, tentukan bilangan sel ialah 1 × 10⁵, dan gunakan pipet untuk mengeluarkan medium kultur daripada hidangan kultur.

1.1.2.Tambah 200 μl 1 × PBS yang telah disejukkan ke setiap telaga.Jangan pipet berulang kali dan keluarkan PBS dari telaga.Condongkan pinggan dan keluarkan sebanyak mungkin PBS.Teruskan ke langkah 2.

1.1.3.Hidangan kultur sel yang berbeza atau jadual nombor rujukan 1-1 dalam hidangan kultur sel telah ditambah 1 × PBS yang telah disejukkan terlebih dahulu untuk pencucian sel.

Jadual1-1: Dos PBS untuk bilangan sel yang berbeza

Catatan：Untuk memastikan sel melekat yang kukuh，sebilangan besar kehilangan sel dapat dielakkan semasa mencuci.

1.2.Sel ampaian atau sel melekat yang dikultur dalam plat tidak berliang

1.2.1.Sel melekat yang dikultur dalam plat bukan berbilang perigi (sel ampaian bermula dari langkah seterusnya 1.2.2), kumpulkan dan asingkan sel mengikut kaedah pengumpulan sel biasa, dan letakkannya dalam plat kultur atau tiub emparan;jika trypsinization digunakan, perlukan sentrifugasi untuk mengumpul sel-sel dan untuk membuang sisa tripsin, tambah PBS sel-sel yang digantung semula ke dalam sel individu untuk menyebarkan sel.

1.2.2.Selepas bilangan sel dikira, sel aliquoted 1×10⁵ satu ke tiub sentrifuge, kumpulkan sel dengan sentrifugasi pada 1000 × g selama 10 min.

1.2.3.Tambah 200 μl PBS ke dalam tiub emparan, jangan pipet berulang kali, dan terus aspirasikan PBS.teruskan ke langkah 2. (Jika sukar untuk mendakan dan sel digantung semula, boleh dilakukan 1000×g disentrifugasi 10 minit selepas membuang supernatan, pelet sel meneruskan ke langkah 2)

2.Lisis sel: Keluarkan Penampan CL, suhunya diseimbangkan dengan suhu bilik, Pemadam DNA dan Foregene Protease Plus II, mengikut jadual berikut 1-2 sistem lisis yang disediakan: (Larutan lisis sedia untuk digunakan).

Jadual1-2: belahan penyediaan sistem (Nota: dalam penyediaan di atas ais)

3.( 24 –plat perigi sebagai contoh ) Pipet 200 μl campuran induk lisis sel ke dalam setiap perigi, Tiup berulang kali 5-10 kali, Inkubasi pada suhu bilik (20-25 ℃ ) selama 5 minit.

Catatan：Untuk mengelakkan pembentukan buih, sila apabila skala pipet pipet dilaraskan kepada 200μl atau kurang.Sel-sel mungkin kelihatan keruh selepas lisis, yang merupakan perkara biasa.

4.(24 –plat perigi sebagai contoh ) ditambah dalam cecair 20 μl Penampan ST (sistem lisis berbeza Penampan ST ditambah dalam amaun yang ditunjukkan dalam Jadual 1-3), paip berulang 5-10 kali, pada suhu bilik(20-25 ℃ ) diinkubasi selama 2 minit.

Catatan：Hujung pipet dilupuskan di bawah permukaan, memastikan lisat ditambah，untuk mengelakkan pembentukan buih, sila apabila skala pipet pipet dilaraskan kepada 200μl atau kurang.

Jadual 1-3：Tambah Penampan ST

5. Lisat digunakan untuk eksperimen RT-qPCR seterusnya.Jika eksperimen seterusnya tidak dapat dilakukan dalam masa, sila simpan di atas ais selama tidak lebih daripada 2 jam, dan simpan pada -20 ℃ atau -80 ℃ ( tidak lebih daripada tiga bulan ).

B: Penyediaan sistem RT

1. Keluarkan 5 × Direct RT Mix dan letakkan di atas tab mandi ais, biarkan ia cair secara semula jadi, dan gaul perlahan-lahan untuk kegunaan kemudian;keluarkan ddH2O Bebas RNase dan cairkannya dan letakkan di atas tab mandi ais untuk kegunaan kemudian.Sediakan sistem tindak balas pada ais mengikut Jadual 2-1 di bawah.

Jadual 2-1: Penyediaan sistem tindak balas RT

2.Setelah selesai rumusan sistem, campurkan perlahan-lahan dan disentrifugasi secara ringkas dalam jadual berikut 2 -2 keadaan tindak balas tindak balas RT.

Jadual 2-2: Tetapan keadaan tindak balas RT

3. Selepas selesai tindak balas, produk tindak balas diletakkan terus di atas ais untuk qPCR, sila letakkan pemeliharaan jangka panjang -20 ℃ atau -80 ℃ .

Nota: Disebabkan penggunaan templat yang tidak ditulenkan, mendakan putih mungkin muncul dalam produk transkripsi terbalik.Ini adalah fenomena biasa.Sentrifuge supernatan dengan segera untuk eksperimen seterusnya.

Penyelesaian tindak balas RT yang terhasil ditambah kepada sistem tindak balas PCR Masa Nyata Langkah seterusnya, adalah disyorkan untuk menambah jumlah antara 10-30% daripada sistem tindak balas.

C: penyediaan sistem tindak balas qPCR

1. Jumlah B yang sesuai disediakan dalam templat cDNA langkah mengikut jadual 3-1 berikut untuk menyediakan sistem tindak balas.

Nota: Jumlah templat cDNA menyumbang 10-30% daripada sistem qPCR.Sebagai contoh, dalam sistem qPCR 20μl, tambahkan 2-6 μl penimbal lisis, tetapi tidak lebih daripada 6 μl.

2. Pengoptimuman keadaan qPCR yang baik (Suhu penyepuhlindapan, dll.) untuk tindak balas qPCR (Keadaan tindak balas yang diberikan pada Jadual 3-2 ).

Nota: Cuba gunakan keadaan yang dioptimumkan untuk tindak balas qPCR untuk mendapatkan hasil yang lebih baik.

Jadual 3-1: Penyediaan sistem tindak balas PCR

1*: Kepekatan primer boleh dilaraskan dalam julat 50-900 nM apabila prestasi tindak balas primer lemah.

Nota: Sistem qPCR boleh dilaraskan mengikut keperluan eksperimen dan model kitar pendarfluor.Untuk qPCR dalam 50μl sistem, laraskan dos reagen secara berkadaran mengikut 20μl sistem.

2*: Pilih kepekatan akhir ROX Reference Dye yang sesuai mengikut pendarfluor pendarfluor terma kuantitatif.Kepekatan Pewarna Rujukan ROX yang paling sesuai untuk kitar kuantitatif pendarfluor biasa ditunjukkan dalam jadual di bawah:

Jadual 3-2: keadaan tindak balas qPCR disediakan

Nota: Untuk mendapatkan kesan qPCR yang terbaik, PCR kecerunan boleh digunakan untuk mengoptimumkan keadaan tindak balas untuk templat yang berbeza dan primer yang berbeza.Keadaan tindak balas PCR berbeza-beza bergantung pada penganalisis pendarfluor, templat, primer, dll. Dalam operasi khusus, keadaan tindak balas optimum perlu direka bentuk mengikut keadaan khusus pendarfluor pendarfluor haba kuantitatif, jenis templat, saiz serpihan yang diminati, jujukan asas serpihan yang dikuatkan dan kandungan GC dan panjang primer, termasuk suhu penyepuhlindapan, masa tindak balas, dsb.

Prinsip reka bentuk primer PCR Masa Nyata

Primer Hadapan dan Primer Songsang

Untuk PCR Masa Nyata, reka bentuk primer adalah sangat penting.Primer berkaitan dengan kekhususan dan kecekapan penguatan PCR, dan boleh direka bentuk dengan merujuk kepada prinsip berikut:

◆ Panjang primer: 18-30bp.

◆ Kandungan GC: 40-60%.

◆ Nilai Tm: Perisian reka bentuk primer, seperti Primer 5, boleh memberikan nilai Tm primer.Nilai Tm primer huluan dan hiliran hendaklah sedekat mungkin.Formula pengiraan Tm juga boleh digunakan: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Apabila melakukan PCR, suhu di bawah nilai Tm primer 5 °C biasanya dipilih sebagai suhu penyepuhlindapan (peningkatan yang sepadan dalam suhu penyepuhlindapan boleh meningkatkan kekhususan tindak balas PCR).

◆ Primer dan produk PCR:

◆ Panjang produk penguatan PCR primer reka bentuk adalah sebaik-baiknya 100-150bp.

◆ Primer reka bentuk di kawasan struktur sekunder templat hendaklah dielakkan sebaik mungkin.

◆ Elakkan pembentukan 2 atau lebih asas pelengkap antara hujung 3′ primer hulu dan hilir.

◆ Pangkalan terminal primer 3′ tidak boleh hadir dengan 3 G atau C tambahan berturut-turut.

◆ Primer itu sendiri tidak boleh mempunyai struktur pelengkap, jika tidak, struktur jepit rambut akan terbentuk, menjejaskan penguatan PCR.

◆ ATCG harus diagihkan sekata mungkin dalam urutan primer, dan pangkalan terminal 3′ harus dielakkan sebagai T.

Lampiran1：Cell LangsungRT-qPCR Komponen kitt pek tambahan

1.Penyelesaian Lisis Sel