Telah diketahui umum bahawa dalam dogma pusat, RNA adalah pengantara transkrip antara DNA dan ekspresi protein.Berbanding dengan pengesanan DNA, pengesanan RNA boleh lebih objektif mencerminkan ekspresi gen dalam organisma.Eksperimen yang melibatkan RNA termasuk: qRT-PCR, RNA-Seq, dan pengesanan gen gabungan, dsb. Berdasarkan ciri-ciri RNA itu sendiri (cincin gula RNA mempunyai satu lagi kumpulan hidroksil bebas daripada cincin gula DNA), ditambah pula dengan sejumlah besar RNases dalam persekitaran, RNA lebih tidak stabil dan lebih mudah untuk direndahkan daripada DNA.Sampah masuk, sampah keluar, jika kualiti RNA tidak baik, maka keputusan eksperimen mestilah tidak memuaskan, khususnya dimanifestasikan sebagai data tidak tepat atau kebolehulangan yang lemah.Oleh itu, lebih banyak perhatian harus diberikan kepada pemprosesan RNA, dan pautan kawalan kualiti juga lebih penting untuk memastikan ketepatan dan ketepatan data eksperimen seterusnya.

Untuk kawalan kualiti RNA, biasanya terdapat kaedah berikut yang biasa digunakan:

• Spektrofotometri
• elektroforesis gel agarose
• Penganalisis Bio Agilent
• PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata
• Kaedah pewarna pendarfluor Qubit

01 Spektrofotometri

RNA mempunyai ikatan berganda terkonjugasi dan mempunyai puncak serapan pada panjang gelombang 260nm.Mengikut undang-undang Lambert-Beer, kita boleh mengira kepekatan RNA dari puncak penyerapan pada 260nm.Selain itu, kita juga boleh mengira ketulenan RNA mengikut nisbah puncak serapan 260nm, 280nm dan 230nm.280nm dan 230nm ialah puncak penyerapan protein dan molekul kecil, masing-masing.Nisbah A260/A280 dan A260/A230 bagi ketulenan RNA yang layak hendaklah lebih besar daripada 2. Jika kurang daripada 2, bermakna terdapat pencemaran protein atau molekul kecil dalam sampel RNA dan perlu ditulenkan semula.Sumber pencemaran akan menjejaskan eksperimen hiliran, seperti menghalang kecekapan amplifikasi tindak balas PCR, mengakibatkan keputusan kuantitatif yang tidak tepat.Ketulenan RNA mempunyai pengaruh yang besar pada keputusan seterusnya, jadi spektrofotometri secara amnya merupakan pautan kawalan kualiti yang sangat diperlukan dalam langkah pertama dalam eksperimen asid nukleik.

Rajah 1. Spektrum Penyerapan RNA/DNA biasa

02 Elektroforesis gel agarose

Selain ketulenan, integriti RNA juga merupakan salah satu petunjuk penting untuk menilai kualiti RNA.Degradasi RNA akan membawa kepada sejumlah besar serpihan pendek dalam sampel, jadi bilangan serpihan RNA yang boleh dikesan dengan berkesan dan diliputi oleh jujukan rujukan akan dikurangkan.Integriti RNA boleh diperiksa dengan elektroforesis jumlah RNA pada gel agarose 1%.Kaedah ini boleh mengkonfigurasi gel sendiri, atau menggunakan Sistem E-Gel™ pasang siap untuk ujian integriti.Lebih daripada 80% daripada jumlah RNA ialah RNA ribosom, yang majoritinya terdiri daripada rRNA 28S dan 18S (dalam sistem mamalia).RNA berkualiti baik akan menunjukkan dua bar terang yang jelas, iaitu bar terang 28S dan 18S, masing-masing, pada 5 Kb dan 2 Kb, dan nisbahnya akan cenderung hampir kepada 2:1.Jika ia berada dalam keadaan meresap, ini bermakna sampel RNA mungkin telah terdegradasi, dan disyorkan untuk menggunakan kaedah yang diterangkan kemudian untuk menguji lagi kualiti RNA.

Rajah 2. Perbandingan RNA terdegradasi (lorong 2) dan RNA utuh (lorong 3) pada elektroforesis gel agarose

03 Penganalisis Bio Agilent

Sebagai tambahan kepada kaedah elektroforesis gel agarose yang diterangkan di atas, yang boleh membantu kita mengenal pasti integriti RNA dengan mudah dan cepat, kita juga boleh menggunakan bioanalyzer Agilent untuk menentukan integriti RNA.Ia menggunakan gabungan mikrobendalir, elektroforesis kapilari, dan pendarfluor untuk menilai kepekatan dan integriti RNA.Dengan menggunakan algoritma terbina dalam untuk menganalisis profil sampel RNA, bioanalyzer Agilent boleh mengira nilai integriti RNA rujukan, Nombor Integriti RNA (selepas ini dirujuk sebagai RIN) [1].Semakin besar nilai RIN, semakin tinggi integriti RNA (1 sangat terdegradasi, 10 adalah yang paling lengkap).Beberapa eksperimen yang melibatkan RNA mencadangkan menggunakan RIN sebagai parameter untuk penilaian kualiti.Mengambil eksperimen penjujukan throughput tinggi (selepas ini dirujuk sebagai NGS) sebagai contoh, garis panduan Oncomine™ Human Immune Repertoire, yang digunakan untuk mengesan reseptor antigen sel B dan sel T dalam siri panel Oncomine Thermo Fisher, mencadangkan bahawa sampel dengan nilai RIN lebih besar daripada 4, Bacaan dan klon yang lebih berkesan boleh diukur (Rajah 3).Terdapat julat disyorkan yang berbeza untuk panel yang berbeza, dan selalunya RIN yang lebih tinggi boleh membawa data yang lebih berkesan.

Rajah 3, dalam eksperimen Oncomine™ Human Immune Repertoire, sampel dengan RIN lebih daripada 4 boleh mengesan bacaan yang lebih berkesan dan klon sel T.【2】

Walau bagaimanapun, nilai RIN juga mempunyai beberapa batasan.Walaupun RIN mempunyai korelasi yang tinggi dengan kualiti data eksperimen NGS, ia tidak sesuai untuk sampel FFPE.Sampel FFPE telah dirawat secara kimia untuk masa yang lama, dan RNA yang diekstrak secara amnya mempunyai nilai RIN yang agak rendah.Walau bagaimanapun, ini tidak bermakna bahawa data berkesan eksperimen mestilah tidak memuaskan.Untuk menilai dengan tepat kualiti sampel FFPE, kita perlu menggunakan ukuran selain RIN.Selain RIN, bioanalyzer Agilent juga boleh mengira nilai DV200 sebagai parameter penilaian kualiti RNA.DV200 ialah parameter yang mengira bahagian serpihan yang lebih besar daripada 200 bp dalam sampel RNA.DV200 ialah penunjuk kualiti sampel FFPE yang lebih baik daripada RIN.Untuk RNA yang diekstrak oleh FFPE, ia mempunyai korelasi yang sangat tinggi dengan bilangan gen yang boleh dikesan dengan berkesan dan kepelbagaian gen [3].Walaupun DV200 boleh menampung kekurangan dalam pengesanan kualiti FFPE, bioanalisis Agilent masih tidak dapat menganalisis masalah kualiti dalam sampel RNA secara menyeluruh, termasuk sama ada terdapat perencat dalam sampel.Inhibitor sendiri boleh menjejaskan kecekapan amplifikasi eksperimen hiliran dan mengurangkan jumlah data berguna.Untuk mengetahui sama ada terdapat perencat dalam sampel, kita boleh menggunakan kaedah PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata yang diterangkan seterusnya.

04 PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata

Kaedah PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata bukan sahaja dapat mengesan perencat dalam sampel, tetapi juga mencerminkan dengan tepat kualiti RNA dalam sampel FFPE.Berbanding dengan penganalisis biologi Agilent, instrumen kuantitatif pendarfluor masa nyata lebih popular di makmal biologi utama kerana penggunaannya yang lebih luas.Untuk menguji kualiti sampel RNA, kami hanya perlu membeli atau menyediakan probe primer untuk gen rujukan dalaman, seperti GUSB (Cat no. Hs00939627).Dengan menggunakan set primer, probe dan piawai ini (jumlah RNA kepekatan yang diketahui) untuk menjalankan eksperimen kuantitatif mutlak, kepekatan serpihan RNA yang berkesan boleh dikira sebagai piawai penilaian kualiti RNA (pendek kata Kuantiti RNA Fungsian (FRQ).Dalam ujian NGS, kami mendapati bahawa FRQ sampel RNA mempunyai korelasi yang sangat tinggi dengan volum data yang berkesan.Untuk semua sampel yang lebih besar daripada 0.2ng/uL FRQ, sekurang-kurangnya 70% bacaan boleh merangkumi jujukan rujukan dengan berkesan (Rajah 4).

Rajah 4, nilai FRQ yang dikesan oleh kaedah kuantitatif pendarfluor mempunyai korelasi yang sangat tinggi (R2>0.9) dengan data berkesan yang diperolehi dalam eksperimen NGS.Garis merah ialah nilai FRQ bersamaan dengan 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Selain boleh digunakan untuk sampel FFPE, kaedah PCR kuantitatif masa nyata juga boleh memantau perencat dalam sampel dengan berkesan.Kita boleh menambah sampel untuk dikesan ke dalam sistem tindak balas dengan Kawalan Positif Dalaman (IPC) dan Ujiannya, dan kemudian melakukan kuantifikasi pendarfluor untuk mendapatkan nilai Ct.Jika nilai Ct ketinggalan daripada nilai Ct dalam tindak balas tanpa sampel, ia menunjukkan bahawa perencat hadir dalam sampel dan menghalang kecekapan amplifikasi dalam tindak balas.

05 kaedah pewarna pendarfluor Qubit

Qubit Fluorometer ialah peranti kecil yang paling biasa digunakan untuk kepekatan asid nukleik dan pengesanan ketulenan, yang mudah dikendalikan dan wujud dalam hampir setiap makmal biologi molekul.Ia mengira kepekatan asid nukleik dengan tepat dengan pengesanan dan pewarna pendarfluor pengikat asid nukleik (reagen pengesanan Qubit).Qubit mempunyai kepekaan dan kekhususan yang tinggi, dan boleh mengukur RNA dengan tepat ke kepekatan pg/µL.Sebagai tambahan kepada keupayaan terkenal untuk mengukur kepekatan asid nukleik dengan tepat, model baharu terbaru Thermo Fisher, Qubit 4.0, juga boleh mengesan integriti RNA.Sistem pengesanan RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) mengesan integriti RNA dengan mengesan dua pewarna pendarfluor tertentu secara serentak.Kedua-dua pewarna pendarfluor ini boleh mengikat serpihan besar dan serpihan kecil RNA, masing-masing.Kedua-dua pewarna pendarfluor ini menunjukkan perkadaran serpihan besar RNA dalam sampel, dan daripada ini nilai IQ (Integriti dan Kualiti) yang mewakili kualiti RNA boleh dikira.Nilai IQ boleh digunakan untuk kedua-dua sampel FFPE dan bukan FFPE, dan mempunyai pengaruh yang besar pada kualiti penjujukan berikutnya.Mengambil eksperimen NGS sebagai contoh, dalam eksperimen ujian RNA-Seq yang dilakukan pada platform Ion torrent™, kebanyakan sampel dengan nilai IQ lebih daripada 4 mempunyai sekurang-kurangnya 50% bacaan berkesan (Rajah 5).Berbanding dengan kaedah pengesanan yang dinyatakan di atas, Qubit IQ Assay bukan sahaja lebih mudah untuk beroperasi dan mengambil masa yang lebih singkat (dalam masa lima minit), tetapi juga mempunyai korelasi yang hebat antara nilai IQ parameter yang diukur dan kualiti data eksperimen hiliran.

Rajah 5, terdapat korelasi yang hebat antara nilai IQ RNA Qubit dan bacaan dipetakan RNA-Seq.【5】

Melalui pengenalan di atas, saya percaya bahawa setiap orang mempunyai pemahaman yang mencukupi tentang kaedah kawalan kualiti RNA yang berbeza.Dalam amalan, anda boleh memilihkaedah yang sepadan mengikut jenis sampel dan instrumen sedia ada.Hanya dengan mengawal kualiti RNA dengan baik kita boleh mengelakkan kegagalan eksperimen berikutnya yang disebabkan oleh kualiti sampel yang lemah, sekali gus menjimatkan masa, tenaga dan kos yang berharga.

Produk rujukan:

Kit Pengasingan RNA Jumlah Haiwan

Kit Pengasingan RNA Jumlah Sel

rujukan

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: nombor integriti RNA untuk memberikan nilai integriti kepada pengukuran RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Panduan Pengguna Repertoir Kekebalan Manusia Oncomine (No. Penerbitan MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrik Kualiti Dipertingkatkan untuk Menilai RNA Yang Diperoleh Daripada Sampel Tisu Terbenam Parafin Tetap Formalin Arkib, Sains Toksikologi, Jilid 170, Terbitan 37 Ogos, Jilid 170, Terbitan 37 Ogoshttps://doi.org/10.1093/toxsci/