Escherichia coli O157:H7 Kit Pengesanan Asid Nukleik (Kaedah Siasatan Pendarfluor PCR)
Penerangan Kit:
Kucing.No.FP102
Ia digunakan untuk pengesanan pantas dan saringan E. coli O157:H7 dalam makanan, makanan, sampel air dan sampel persekitaran.
Penerangan
Ia digunakan untuk pengesanan pantas dan saringan E. coli O157:H7 dalam makanan, makanan, sampel air dan sampel persekitaran.
[Prinsip ujian]Mengikut prinsip teknologi PCR pendarfluor, primer khusus dan probe Taqman direka untuk gen spesifik Escherichia coli O157: H7, dan dikesan oleh instrumen PCR pendarfluor, supaya dapat merealisasikan pengesanan Escherichia coli O157: H7 Pengesanan kualitatif DNA.
Kandungan Kit
Nota: Probe saluran ROX tidak disertakan.
| Clawan | Spesifikasi | Quantity |
| Penampan A | tiub | 1 |
| Penampan B | tiub | 1 |
| Kawalan positif | tiub | 1 |
| Kawalan negatif | tiub | 1 |
Jangkaan Penggunaan
Ia digunakan untuk pengesanan pantas dan saringan E. coli O157:H7 dalam makanan, makanan, sampel air dan sampel persekitaran.
Keadaan Penyimpanan Dan Tarikh Luput
Simpan pada -20 ℃ dalam gelap dan elakkan pembekuan dan pencairan berulang.
Tempoh sah ialah 12bulan, dan tarikh pengeluaran ditunjukkan pada pembungkusan luar.
Instrumen Dan Bahan Habis
Alat PCR kuantitatif pendarfluor, pistol pipet dan petua padanan, penggoncang vorteks, emparan mini.
Penggunaan
1. Pemprosesan Sampel
1.1 Jenis sampel: Kit ini sesuai untuk sampel makanan, makanan, air dan sampel lain yang disyaki tercemar oleh Escherichia coli O157:H7.Untuk produk daging yang diproses dalam, minuman dan bahan lain yang mengandungi pigmen, ia perlu dibilas untuk mengelak daripada menjejaskan pengumpulan isyarat pendarfluor.
1.2 Pemprosesan sampel: Rujuk kepada "GB 4789.10-2016 Keselamatan Makanan Peperiksaan Mikrobiologi Makanan Standard Kebangsaan Escherichia coli O157: Ujian H7" untuk penyediaan sampel, kultur pengayaan dan pengasingan Escherichia coli O157: H7.
- Npengekstrakan asid ukleik
Ambil 20 mL larutan pengayaan dalam tiub emparan 1.5 mL, tambah 200 μL lisat mikrob (kit tambahan diperlukan), vorteks selama 30 saat, sentrifuge sebentar, dan ketepikan.
Catatan: Pengekstrakan asid nukleik daripada lysate perlu diselesaikan dalam masa 10 minit, dan tidak boleh disimpan untuk masa yang lama.
3. Penguatan Asid Nukleik
3.1 Hidupkan instrumen PCR kuantitatif pendarfluor untuk digunakan.
Penampan A dan Penampan B daripada kit , cairkannya dengan teliti, dan sentrifuge sebentar.Tambah 18 μL Penampan A dan 2 μL Penampan B ke setiap tiub tindak balas PCR.Kemudian tambahkan 5 mL setiap satu kawalan negatif, asid nukleik yang diekstrak, dan kawalan positif ke dalam tiub tindak balas PCR, tutup tiub, dan empar sebentar.
3.3 Pindahkan tiub tindak balas PCR ke mesin PCR pendarfluor, dan gunakan prosedur berikut untuk melakukan eksperimen penguatan: pilih 25 mL untuk sistem tindak balas, kumpulkan isyarat pendarfluor pada 60°C untuk setiap kitaran, dan pilih FAM untuk saluran pengesanan.
| Langkah | Program | Bilangan kitaran |
| 1 | 37℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (kumpul pendarfluor) |
Panduan untuk analisis masalah
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Tiada RNA boleh diekstrak atau hasil asid nukleik adalah rendah
Biasanya terdapat banyak faktor yang mempengaruhi kecekapan pemulihan, seperti: kandungan RNA sampel, kaedah operasi, volum elusi, dsb.
Analisis punca biasa：
1. Mandian ais atau sentrifugasi suhu rendah (4 ° C) semasa operasi.
Cadangan: Operasi suhu bilik (15-25 ° C), jangan sekali-kali mandi ais dan centrifuge suhu rendah.
2. Penyimpanan sampel yang tidak betul atau penyimpanan sampel terlalu lama.
Cadangan: Simpan sampel pada -80 ° C atau beku dalam nitrogen cecair, dan elakkan penggunaan beku-cair berulang;cuba gunakan sampel yang baru dikumpul untuk pengekstrakan RNA.
3. Lisis sampel tidak mencukupi
Syor: Sila pastikan bahawa sampel dan larutan berfungsi (Linear Acrylamide) telah dicampur dengan teliti dan diinkubasi selama 10 minit pada suhu bilik (15-25 ° C)
4.Eluen telah ditambah dengan tidak betul
Pengesyoran: Pastikan ddH2O Bebas RNase ditambahkan pada bahagian tengah membran lajur penulenan
5. Isipadu tidak betul etanol kontang dalam Penampan viRW2
Cadangan: Sila ikut arahan, tambahkan isipadu etanol kontang yang betul ke dalam Penampan viRW2 dan gaulkannya dengan baik sebelum menggunakan kit.
6. Penggunaan sampel yang tidak betul.
Cadangan: 200µl sampel setiap 500µl Buffer viRL.Jumlah sampel yang berlebihan akan mengakibatkan kadar pengekstrakan RNA berkurangan.
7. Isipadu elusi yang tidak betul atau elusi yang tidak lengkap.
Cadangan: Isipadu eluen lajur penulenan ialah 30-50μl;jika kesan elusi tidak memuaskan, disyorkan untuk menambah ddH Bebas RNase yang telah dipanaskan.2O dan lanjutkan masa meletakkan pada suhu bilik, seperti 5-10min
8. Lajur penulenan mempunyai sisa etanol selepas dibilas dalam Penampan viRW2.
Cadangan: Jika etanol masih kekal selepas dibilas dalam Buffer viRW2 dan sentrifugasi tiub kosong selama 2 minit, lajur penulenan boleh dibiarkan pada suhu bilik selama 5 minit selepas sentrifugasi tiub kosong untuk mengeluarkan sepenuhnya baki etanol.
Degradasi molekul RNA yang telah dimurnikan
Kualiti RNA yang disucikan adalah berkaitan dengan faktor seperti penyimpanan sampel, pencemaran RNase dan operasi.
Analisis punca biasa：
1. Sampel yang dikumpul tidak disimpan dalam masa.
Cadangan: Jika sampel tidak digunakan dalam masa selepas pengumpulan, sila simpan pada -80 ℃ atau nitrogen cecair dengan segera.Untuk pengekstrakan molekul RNA, cuba gunakan sampel yang baru dikumpul apabila boleh.
2. Sampel yang dikumpul dibekukan dan dicairkan berulang kali.
Cadangan: Elakkan pembekuan dan pencairan berulang (tidak lebih daripada sekali) semasa pengumpulan dan penyimpanan sampel, jika tidak, hasil asid nukleik akan berkurangan.
3. RNase diperkenalkan di dalam bilik pembedahan atau tiada sarung tangan pakai buang, topeng dan sebagainya dipakai.
Cadangan: Eksperimen pengekstrakan molekul RNA paling baik dilakukan dalam bilik operasi RNA yang berasingan, dan meja eksperimen dibersihkan sebelum eksperimen.Pakai sarung tangan pakai buang dan topeng semasa eksperimen untuk mengelakkan degradasi RNA yang disebabkan oleh pengenalan RNase.
4. Reagen tercemar oleh RNase semasa penggunaan.
Cadangan: Gantikan dengan Kit Pengasingan RNA Viral baharu untuk eksperimen berkaitan.
5. Pencemaran RNase pada tiub emparan, hujung pipet, dsb. Cadangan: Pastikan tiub emparan, hujung pipet dan pipet semuanya Bebas RNase.
Molekul RNA yang telah disucikan menjejaskan eksperimen hiliran
Molekul RNA yang disucikan oleh lajur penulenan akan menjejaskan eksperimen hiliran jika terdapat terlalu banyak ion garam atau protein, seperti: transkripsi terbalik, Northern Blot, dsb.
1. Terdapat baki ion garam dalam molekul RNA yang dicairkan.
Syor: Pastikan isipadu etanol kontang yang betul telah ditambahkan pada Penampan viRW2, dan basuh lajur penulenan dua kali mengikut kelajuan pengemparan yang betul pada arahan pengendalian; Jika masih ada ion garam yang tinggal, anda boleh menambah Penampan viRW2 ke lajur penulenan, dan biarkan pada suhu bilik selama 5 minit.Kemudian lakukan sentrifugasi untuk membuang pencemaran ion garam ke tahap yang paling besar
2. Terdapat baki etanol dalam molekul RNA yang dicairkan
Cadangan: setelah mengesahkan bahawa lajur penulenan telah dibilas oleh Penampan viRW2, lakukan sentrifugasi tiub kosong mengikut kelajuan emparan pada arahan pengendalian.Jika masih terdapat baki etanol, ia boleh dibiarkan selama 5 minit pada suhu bilik selepas sentrifugasi tiub kosong untuk mengeluarkan baki etanol sepenuhnya.
Manual Arahan:
Manual Arahan Kit Pengasingan RNA Viral
