1. Pemahaman awal

Pada peringkat ini, kita perlu memahami beberapa konsep dan istilah, supaya dapat mengelak daripada melakukan kesilapan di hadapan senior kita, seperti:

S: Apakah perbezaan antara RT-PCR, qPCR, PCR Masa Nyata dan RT-PCR masa nyata?

Jawapan: RT-PCR ialah PCR transkripsi terbalik(PCR transkripsi terbalik, RT-PCR), yang merupakan varian tindak balas rantai polimerase (PCR) yang digunakan secara meluas.Dalam RT-PCR, untaian RNA ditranskripsikan secara terbalik ke dalam DNA pelengkap, yang kemudiannya digunakan sebagai templat untuk penguatan DNA oleh PCR.
Masa nyata-PCR dan qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) adalah perkara yang sama, kedua-duanya adalah PCR kuantitatif masa nyata, yang bermaksud bahawa setiap kitaran PCR mempunyai rekod data masa nyata, jadi bilangan templat permulaan boleh dilaraskan analisis tepat.

Walaupun kedua-dua PCR Masa Nyata (PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata) dan PCR transkripsi Songsang (PCR transkripsi terbalik) nampaknya disingkatkan sebagai RT-PCR, konvensyen antarabangsa ialah: RT-PCR secara khusus merujuk kepada transkripsi terbalikPCR , PCR masa nyata secara amnya disingkatkan sebagai qPCR (PCR masa nyata kuantitatif).

Dan RT-PCR (RT-qPCR) masa nyata, Ia adalah PCR transkripsi terbalik yang digabungkan dengan teknologi kuantitatif pendarfluor: mula-mula dapatkan cDNA (RT) daripada transkripsi terbalik RNA, dan kemudian gunakan PCR Masa Nyata untuk analisis kuantitatif (qPCR).Kebanyakan makmal melakukan RT-qPCR, iaitu penyelidikan tentang regulasi turun ekspresi RNA, jadi qPCR yang dibincangkan semua orang di makmal sebenarnya merujuk kepada RT-qPCR, tetapi jangan lupa bahawa masih terdapat banyak ujian DNA dalam aplikasi klinikal.Analisis kuantitatif, seperti pengesanan HBV virus hepatitis B.

Soalan: Selepas membaca banyak PCR kuantitatif pendarfluor, mengapakah serpihan yang dikuatkan perlu dikawal dalam julat 80-300bp?

Jawab: Panjang setiap jujukan gen adalah berbeza, ada yang beberapa kb, ada yang beratus-ratus bp, tetapi kita hanya perlu memerlukan panjang produk 80-300bp apabila mereka bentuk primer, terlalu pendek atau terlalu panjang tidak sesuai untuk pengesanan PCR kuantitatif pendarfluor .Serpihan produk terlalu pendek untuk dibezakan daripada primer-dimer.Panjang primer-dimer adalah kira-kira 30-40bp, dan sukar untuk membezakan sama ada ia adalah primer-dimer atau produk jika ia kurang daripada 80bp.Jika serpihan produk terlalu panjang, melebihi 300bp, ia akan dengan mudah membawa kepada kecekapan amplifikasi yang rendah dan tidak dapat mengesan jumlah gen dengan berkesan.

Sebagai contoh, apabila anda mengira bilangan orang di dalam bilik darjah, anda hanya perlu mengira bilangan mulut yang ada.Perkara yang sama berlaku apabila anda mengesan gen, anda hanya perlu mengesan urutan gen tertentu untuk mewakili Seluruh jujukan akan dilakukan.Jika anda ingin mengira orang, anda perlu mengira kedua-dua mulut dan hidung, telinga, dan cermin mata, dan mudah untuk membuat kesilapan.

Untuk mengembangkan, dalam penyelidikan biologi, terdapat banyak kes penyelidikan dari satu titik ke kawasan, kerana jujukan gen mana-mana spesies adalah sangat panjang, adalah tidak perlu dan mustahil untuk mengukur semua serpihan, seperti penjujukan bakteria 16S, iaitu untuk menjalankan urutan konservatif bakteria Assays untuk membuat kesimpulan bilangan populasi bakteria tertentu.

S: Apakah panjang optimum untuk reka bentuk primer qPCR?

Jawab: Secara umumnya, panjang primer adalah kira-kira 20-24bp, yang lebih baik.Sudah tentu, kita mesti memberi perhatian kepada nilai TM primer apabila mereka bentuk primer, kerana ini berkaitan dengan suhu penyepuhlindapan yang optimum.Selepas banyak eksperimen, telah terbukti bahawa 60°C adalah nilai TM yang lebih baik.Jika suhu penyepuhlindapan terlalu rendah, ia dengan mudah akan membawa kepada penguatan tidak spesifik.Jika suhu penyepuhlindapan terlalu tinggi, kecekapan amplifikasi akan menjadi agak rendah, puncak lengkung amplifikasi akan bermula kemudian, dan nilai CT akan ditangguhkan.

S: Bagaimanakah kaedah pewarna berbeza daripada kaedah siasatan?

Jawapan: Kaedah pewarnaSesetengah pewarna pendarfluor, seperti SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, dsb., tidak memancarkan cahaya dengan sendirinya, tetapi akan memancarkan pendarfluor selepas mengikat pada alur kecil DNA untai dua.Oleh itu, pada permulaan tindak balas PCR, mesin tidak dapat mengesan isyarat pendarfluor.Apabila tindak balas mencapai peringkat lanjutan penyepuhlindapan, helai berganda dibuka, dan helai baru disintesis di bawah tindakan polimerase DNA, dan molekul pendarfluor mengikat ke alur kecil dsDNA.Apabila bilangan kitaran PCR meningkat, semakin banyak pewarna digabungkan dengan DNA untai dua, dan isyarat pendarfluor juga terus dipertingkatkan.Kaedah pewarna digunakan terutamanya dalam penyelidikan saintifik.
PS: Berhati-hati semasa melakukan eksperimen, pewarna perlu digabungkan dengan DNA manusia, berhati-hati untuk mengubahnya menjadi orang kalimantang.

Kaedah pewarna (kiri) Kaedah siasatan (kanan)
PS: Berhati-hati semasa melakukan eksperimen, pewarna perlu digabungkan dengan DNA manusia, berhati-hati untuk mengubahnya menjadi orang kalimantang.

SYBR Green Ⅰ mengikat pada alur kecil DNA

Kaedah kuarKuar Taqman adalah kuar hidrolisis yang paling biasa digunakan.Terdapat kumpulan pendarfluor di hujung 5′ probe, biasanya FAM, dan probe itu sendiri adalah urutan pelengkap kepada gen sasaran.Terdapat kumpulan pelindapkejutan pendarfluor pada hujung 3′.Menurut prinsip pemindahan tenaga resonans pendarfluor (pemindahan tenaga resonans förster, fret), apabila kumpulan pendarfluor wartawan (molekul pendarfluor pendarfluor) Ule, sementara autofluorescence lemah.Oleh itu, pada permulaan tindak balas PCR, apabila siasatan bebas dan utuh dalam sistem, kumpulan pendarfluor wartawan tidak akan mengeluarkan pendarfluor.Apabila penyepuhlindapan, primer dan probe mengikat pada templat.Semasa peringkat lanjutan, polimerase secara berterusan mensintesis rantai baru.Polimerase DNA mempunyai aktiviti exonuclease 5'-3'.Apabila mencapai probe, polimerase DNA akan menghidrolisis probe daripada templat, memisahkan kumpulan pendarfluor wartawan daripada kumpulan pendarfluor pelindapkejut, dan melepaskan isyarat pendarfluor.Memandangkan terdapat perhubungan satu dengan satu antara kuar dan templat, kaedah kuar adalah lebih unggul daripada kaedah pewarna dari segi ketepatan dan kepekaan ujian.Kaedah siasatan digunakan terutamanya dalam diagnosis.

S: Apakah kuantiti mutlak?Apakah Kuantiti Relatif?

Jawab: Kuantifikasi mutlak merujuk kepada pengiraan nombor salinan awal sampel yang akan diuji oleh qPCR, seperti bilangan virus HBV dalam 1ml darah.Keputusan yang diperolehi dengan kuantifikasi relatif ialah perubahan dalam jumlah gen sasaran dalam sampel tertentu berbanding sampel rujukan yang lain, dan ekspresi gen dikawal selia atau dikawal ke bawah.

S: Adakah jumlah pengekstrakan RNA, kecekapan transkripsi terbalik dan kecekapan amplifikasi akan menjejaskan keputusan eksperimen?
S: Adakah storan sampel, reagen pengekstrakan, reagen transkripsi terbalik dan bahan guna pemancar cahaya akan menjejaskan keputusan eksperimen?
S: Apakah kaedah yang boleh membetulkan data eksperimen?

Mengenai isu ini, kami akan menerangkannya secara terperinci dalam bahagian lanjutan dan lanjutan di bawah.
2. Pengetahuan lanjutan

Berkenaan dengan PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata, kita mesti mengiktiraf realiti bahawa beribu-ribu kertas penyelidikan saintifik diterbitkan setiap tahun, antaranya teknologi PCR kuantitatif pendarfluor bukanlah jumlah yang kecil.

Jika tiada piawaian biasa untuk mengukur eksperimen PCR kuantitatif pendarfluor, keputusan mungkin berbeza-beza secara meluas.Bagi gen yang sama dari spesies yang sama, dengan kaedah pemprosesan yang sama, hasil pengesanan juga akan berbeza-beza secara meluas, dan sukar bagi mereka yang lewat untuk mengulangi keputusan yang sama.Anda Tiada siapa yang tahu mana yang betul dan yang mana salah.

Adakah ini bermakna bahawa PCR kuantitatif pendarfluor ialah teknologi menipu atau teknologi yang tidak boleh dipercayai?Tidak, ia adalah kerana PCR kuantitatif pendarfluor adalah lebih sensitif dan lebih tepat, dan sedikit operasi yang salah akan menghasilkan keputusan yang bertentangan sepenuhnya.Kerugian kecil adalah seribu batu jauhnya.Pengarang artikel mungkin berulang kali diseksa oleh pengulas.Pada masa yang sama, penyemak jurnal juga sukar untuk memilih daripada keputusan eksperimen yang berbeza.

Secara keseluruhannya, menunjukkan kekurangan konsensus dalam eksperimen PCR masa nyata.Untuk tujuan ini, saintis kanan dalam industri mula merumuskan piawaian,memerlukan penyumbang untuk memberikan beberapa butiran percubaan dan pemprosesan data yang diperlukan (termasuk data yang diperlukan) dalam artikel untuk memenuhi piawaian ini .

Pengulas boleh menilai kualiti percubaan dengan membaca butiran ini;pembaca akan datang juga boleh menggunakan ini untuk mengulangi percubaan atau menambah baik percubaan.Kemudian keputusan eksperimen yang diperoleh dengan cara ini penuh dengan maklumat, berkualiti tinggi, dan boleh digunakan.

MIBBI (Maklumat Minimum untuk Penyiasatan Biologi dan Bioperubatan -http://www.mibbi.org) wujud.MIBBI ialah projek yang menyediakan piawaian untuk eksperimen.Ia diterbitkan dalam alam semula jadi.Projek ini bertujuan untuk pelbagai eksperimen biologi, termasuk biologi sel, Microarray, qPCR yang akan kita bincangkan sekarang, dsb., dan menyediakan untuk setiap jenis eksperimen apabila menyerahkan manuskrip.Maklumat itu harus diberikan pada setiap masa.

Dalam projek MIBBI, terdapat dua artikel berkaitan PCR kuantitatif pendarfluor iaitu:
·RDML (Bahasa Penanda Data PCR Masa Nyata) – bahasa berstruktur dan panduan pelaporan untuk data PCR kuantitatif masa nyata;
·MIQE (Maklumat Minimum untuk Penerbitan Eksperimen PCR Masa Nyata Kuantitatif) – maklumat minimum untuk menerbitkan artikel tentang eksperimen PCR kuantitatif masa nyata.
Pertama, mari kita bercakap tentang RDML, spesifikasi terminologi.

Jika tiada definisi standard untuk segala-galanya, adalah mustahil untuk meneruskan perbincangan, sebab itu penjelasan istilah sangat penting dalam peperiksaan.
Terminologi yang digunakan dalam eksperimen PCR kuantitatif pendarfluor termasuk kandungan berikut.QIAGEN telah membuat ringkasan terbaik untuk kami.Yang berikut semuanya keringbarang .

Keluk penguatan
Lengkung amplifikasi merujuk kepada lengkung yang dibuat semasa proses PCR, dengan nombor kitaran sebagai absis dan intensiti pendarfluor masa nyata semasa tindak balas sebagai ordinat.

Keluk penguatan yang sangat baik harus mempunyai ciri-ciri berikut: garis dasar adalah rata atau sedikit menurun, dan tidak ada aliran menaik yang jelas;titik infleksi lengkung adalah jelas, dan kecerunan fasa eksponen adalah berkadar dengan kecekapan amplifikasi.Lebih besar cerun, lebih tinggi kecekapan amplifikasi;lengkung amplifikasi keseluruhan Keselarian adalah baik, menunjukkan bahawa kecekapan amplifikasi setiap tiub adalah serupa;fasa eksponen lengkung amplifikasi sampel berkepekatan rendah adalah jelas.

Garis Dasar (Baseline)
Garis dasar ialah tahap hingar kitaran awal, biasanya diukur antara kitaran ke-3 dan ke-15, kerana peningkatan nilai pendarfluor yang disebabkan oleh produk penguatan tidak dapat dikesan dalam tempoh ini.Bilangan kitaran yang digunakan untuk mengira garis dasar boleh diubah dan mungkin perlu dikurangkan jika jumlah templat yang tinggi digunakan atau jika tahap ekspresi gen sasaran adalah tinggi.

Menetapkan garis dasar memerlukan melihat data pendarfluor daripada lengkung penguatan lineariti.Garis dasar ditetapkan supaya pertumbuhan lengkung amplifikasi bermula dengan nombor kitaran yang lebih besar daripada nombor atas kitaran garis dasar.Garis dasar perlu ditetapkan secara individu untuk setiap urutan sasaran.Purata nilai pendarfluor yang dikesan dalam kitaran awal perlu ditolak daripada nilai pendarfluor yang diperoleh dalam produk yang dikuatkan.Versi terkini pelbagai perisian PCR Masa Nyata membenarkan pengoptimuman automatik tetapan garis dasar untuk sampel individu.

Semasa beberapa kitaran pertama tindak balas penguatan PCR, isyarat pendarfluor tidak banyak berubah.Mendekati garis lurus dipanggil garis dasar, tetapi jika kita melihat dengan teliti pada beberapa kitaran pertama, kita melihat bahawa dalam garis dasar adalah apa yang berlaku dalam gambar di bawah.

Latar Belakang Latar merujuk kepada
nilai pendarfluor bukan spesifik dalam tindak balas .Contohnya: pelindapkejutan pendarfluor yang tidak cekap;atau sebilangan besar templat DNA untai dua kerana penggunaan SYBR Green.Komponen latar belakang isyarat dikeluarkan secara matematik oleh algoritma perisian PCR Masa Nyata.

Isyarat wartawan
Isyarat wartawan merujuk kepada isyarat pendarfluor yang dijana oleh SYBR Green atau kuar khusus jujukan berlabel pendarfluor semasa PCR Masa Nyata.

Isyarat Wartawan Dinormalisasi (RN)
RN merujuk kepada keamatan pendarfluor pewarna wartawan dibahagikan dengan keamatan pendarfluor pewarna rujukan pasif yang diukur pada setiap kitaran.

Pewarna Rujukan Pasif
Dalam sesetengah PCR Masa Nyata,pewarna pendarfluor ROX digunakan sebagai rujukan dalaman untuk menormalkan isyarat pendarfluor.Ia membetulkan variasi akibat pemipetan yang tidak tepat, kedudukan telaga, dan turun naik pendarfluor berdasarkan sumur demi telaga.

Ambang pendarfluor (ambang)
telah dilaraskan di atas nilai latar belakang dan ketara di bawah nilai dataran tinggi lengkung amplifikasi.Ia mesti terletak pada kawasan linear lengkung amplifikasi, yang mewakili julat log-linear pengesanan PCR.Ambang harus ditetapkan dalam paparan lengkung penguatan log supaya fasa log-linear PCR mudah dikenal pasti.Jika terdapat berbilang gen sasaran dalam PCR Masa Nyata, ambang mesti ditetapkan untuk setiap sasaran .Secara amnya, isyarat pendarfluor 15 kitaran pertama tindak balas PCR digunakan sebagai isyarat latar belakang pendarfluor, dan ambang pendarfluor ialah 10 kali sisihan piawai bagi isyarat pendarfluor bagi 3 hingga 15 kitaran PCR pertama, dan ambang pendarfluor ditetapkan dalam fasa eksponen penguatan PCRSecara umum, setiap instrumen mempunyai ambang pendarfluor yang ditetapkan sebelum digunakan.

Ambang Kitaran (CT) atau Titik Persimpangan (CP)
Kitaran di mana lengkung amplifikasi melepasi ambang (iaitu, titik di mana pengesanan pendarfluor meningkat dengan ketara).CT boleh menjadi pecahan dan jumlah templat permulaan boleh dikira.Nilai CT mewakili bilangan kitaran yang dialami apabila isyarat pendarfluor dalam setiap tiub tindak balas PCR mencapai ambang yang ditetapkan.Terdapat hubungan linear antara nilai CT setiap templat dan logaritma nombor salinan awal templat,lebih tinggi nombor salinan awal, lebih kecil nilai CT, dan sebaliknya.Lengkung piawai boleh dibuat dengan menggunakan piawai dengan nombor salinan awal yang diketahui, di mana absis mewakili nilai CT, dan ordinat mewakili logaritma nombor salinan awal.Oleh itu, selagi nilai CT sampel yang tidak diketahui diperolehi, nombor salinan awal sampel boleh dikira daripada lengkung piawai.

nilai ΔCT
Nilai ΔCT menerangkanperbezaan antara gen sasaran dan nilai CT gen rujukan endogen yang sepadan, seperti gen pengemasan, dan digunakan untuk menormalkan jumlah templat yang digunakan:
⇒ΔCT = CT (gen sasaran) – CT (gen rujukan endogen)

Nilai ΔΔCT
Nilai ΔΔCT menerangkan perbezaan antara nilai min ΔΔCT sampel yang diminati (cth, sel yang dirangsang) dan nilai min ΔΔCT sampel rujukan (cth, sel yang tidak dirangsang).Sampel rujukan juga dipanggil sampel penentukuran dan semua sampel lain dinormalkan kepada ini untuk kuantifikasi relatif:
⇒ΔΔCT = purata ΔCT (sampel minat) – purata ΔCT (sampel rujukan)

Gen rujukan endogen (gen rujukan endogen)
Tahap ekspresi gen rujukan endogen, seperti gen pengemasan (gen pengemasan), tidak berbeza antara sampel.Membandingkan nilai CT gen rujukan kepada gen sasaran membolehkan tahap ekspresi gen sasaran dinormalkan kepada jumlah input RNA atau cDNA (lihat bahagian pada nilai ΔCT di atas).

Gen rujukan dalaman betul untukkemungkinan degradasi RNA atau kehadiran perencat enzim dalam sampel RNA, serta variasi dalam kandungan RNA, kecekapan transkripsi terbalik, pemulihan asid nukleik, dan pengendalian sampel.Untuk memilih gen rujukan optimum, kami mengubah suai algoritma untuk membolehkan pemilihan rujukan optimum bergantung pada tetapan eksperimen.

Kawalan dalaman
Urutan kawalan yang dikuatkan dalam tindak balas yang sama seperti jujukan sasaran dan disiasat dengan probe yang berbeza (iaitu, melakukan PCR dupleks).Kawalan dalaman sering digunakan untuk menolak amplifikasi yang gagal, seperti apabila jujukan sasaran tidak dikesan.
Sampel Penentukuran
Sampel rujukan (contohnya, RNA yang disucikan daripada garisan sel atau tisu) yang digunakan dalam kuantifikasi relatif untuk membandingkan semua sampel lain untuk menentukan tahap ekspresi relatif gen.Sampel penentukuran boleh menjadi mana-mana sampel, tetapi biasanya merupakan kawalan (contohnya, sampel yang tidak dirawat atau sampel dari masa sifar eksperimen).

Kawalan positif
gunakan tindak balas kawalan denganjumlah templat yang diketahui.Kawalan positif sering digunakan untuk memeriksa sama ada set primer atau set kuar primer berfungsi dengan betul dan tindak balas disediakan dengan betul.

Tiada Kawalan Templat (NTC)
Tindak balas kawalan yang mengandungi semua komponen tindak balas penguatan yang diperlukan kecuali templat, yang biasanya digantikan dengan air.Penggunaan NTC boleh mencari pencemaran yang disebabkan oleh pencemaran reagen atau DNA asing, sekali gus memastikan ketulenan dan kebolehpercayaan data pengesanan.Penguatan kawalan NTC menunjukkan pencemaran.

Tiada kawalan RT (NRT)
Proses pengekstrakan RNA mungkin mengandungi sisa DNA genomik, yang sangat berbahaya dan merupakan punca yang menjejaskan kualiti data dan musuh semula jadi qPCR, jadi apabila mereka bentuk eksperimen, ia mesti direka untuk hanya menguatkan pengesanan RNA.Terdapat dua cara, satu adalah untuk mereka bentuk primer merentas intron, satu lagi adalah untuk membuang sepenuhnya DNA, yang mana lebih baik, yang akan dibincangkan kemudian.Kawalan NTR adalah cermin ajaib untuk mengesan pencemaran DNA.Jika ada amplifikasi bermakna ada pencemaran.

Piawaian
Piawaian ialah sampel kepekatan yang diketahui atau nombor salinan yang digunakan untuk membina lengkung piawai.Untuk memastikan kestabilan piawai, serpihan gen biasanya diklon ke dalam plasmid dan digunakan sebagai piawai.

Keluk piawai
biasanya dicairkan kepada sekurang-kurangnya 5 kecerunan kepekatan dengan produk standard mengikut nisbah penggandaan, dan 5 mata dilukis dalam koordinat nilai CT dan nombor salinan, dan titik disambungkan untuk membentuk garis untuk menghasilkan lengkung standard.Untuk setiap lengkung piawai, kesahihannya perlu disemak.Nilai cerun jatuh antara -3.3 dan -3.8, dan setiap kepekatan dilakukan dalam tiga kali ganda.Mata yang jauh berbeza daripada mata lain harus dibuang.Nilai CT sampel yang akan diuji dibawa ke dalam lengkung piawai, dan tahap ekspresi sampel yang akan diuji boleh dikira.

Nilai CT sampel yang akan diuji dibawa ke dalam lengkung piawai, dan nombor salinan awal sampel yang akan diuji boleh dikira.

Kecekapan dan Kecerunan
Kecerunan lengkung piawai mewakili kecekapan PCR masa nyata.
·Kecerunan -3.322 menunjukkan bahawa kecekapan amplifikasi PCR adalah 1, atau 100% cekap, dan jumlah produk PCR berganda pada setiap kitaran.
· Cerun kurang daripada –3.322 (cth, –3.8) menunjukkan kecekapan PCR
· Cerun yang lebih besar daripada –3.322 (cth, –3.0) menunjukkan bahawa kecekapan PCR nampaknya lebih besar daripada 100%, yang ingin tahu, bagaimanakah satu kitaran PCR boleh menjana lebih daripada dua kali ganda produk yang dikuatkan?Keadaan ini berlaku dalam fasa bukan linear tindak balas PCR, iaitu, terdapat sejumlah besar penguatan tidak spesifik.

lengkung lebur
Selepas penguatan qPCR selesai, produk PCR dipanaskan.Apabila suhu meningkat, produk penguatan untaian dua secara beransur-ansur cair, mengakibatkan penurunan keamatan pendarfluor.Apabila suhu tertentu (Tm) dicapai, sejumlah besar produk akan cair.Pendarfluor menurun secara mendadak.Produk PCR yang berbeza mempunyai nilai Tm yang berbeza dan suhu lebur yang berbeza, supaya kekhususan PCR dapat dikenal pasti.

Lengkung lebur (lengkung terbitan)
Keluk lebur diperoleh untuk membentuk peta puncak, yang boleh memaparkan keadaan serpihan produk PCR dengan lebih intuitif.Oleh kerana suhu lebur ialah nilai Tm serpihan DNA, beberapa parameter yang mempengaruhi nilai Tm serpihan DNA boleh dinilai, seperti saiz serpihan, kandungan GC, dll. Secara umumnya, mengikut prinsip reka bentuk primer kami,panjang produk yang dikuatkan adalah dalam julat 80-300bp, jadi suhu lebur hendaklah antara 80°C dan 90°C.

Tafsiran keluk lebur: Jika satu-satunya puncak utama muncul antara 80°C-90°C, ini bermakna PCR kuantitatif pendarfluor adalah sempurna;jika puncak utama muncul antara 80°C-90°C dan pelbagai puncak muncul di bawah 80°C, dimer primer pada asasnya dipertimbangkan.Anda boleh cuba meningkatkan suhu penyepuhlindapan untuk menyelesaikannya;jika puncak utama muncul antara 80°C-90°C, dan puncak pelbagai muncul semula apabila suhu meningkat, ia pada asasnya dianggap bahawa terdapat pencemaran DNA, dan DNA perlu dikeluarkan pada peringkat awal eksperimen.

Sudah tentu, masih terdapat beberapa situasi yang tidak normal, yang akan dipecahkan satu per satu di bawah.
3. Pengetahuan lanjutan

Untuk melakukan qPCR, saya perlu katakan MIQE,Maklumat Minimumuntuk PenerbitanKuantitatifPCR Masa NyataEksperimen —maklumat minimum untuk menerbitkan artikel tentang PCR kuantitatif masa nyataeksperimen .Untuk memudahkan pemahaman semua orang, kami akan memudahkan kandungan utama.

Anda boleh mencari teks asal MIQE di Internet, dan perkara yang paling penting ialah ia menetapkansenarai semak data yang perlu disediakan semasa menerbitkan artikel .

Pengulas boleh menilai kualiti percubaan dengan membaca butiran ini;pembaca akan datang juga boleh menggunakan ini untuk mengulang atau menambah baik percubaan.
Perlu diingat bahawa dalam senarai ini, kepentingan setiap senarai ditandakan dengan E atau D masing-masing.Apakah maksudnya?E: maklumat penting (mesti diserahkan);D: maklumat yang diingini (berikan sebanyak mungkin).

MIQE (1)—Reka Bentuk Eksperimen
Ramai bajingan yang telah menyelesaikan pembelaan mereka selepas menamatkan pengajian siswazah mereka tidak akan tahu cara mereka bentuk eksperimen secara bebas, membuka buku nota mereka, dan melakukan apa yang guru suruh mereka lakukan.Akibatnya, reka bentuk eksperimen tidak ketat, dan jabatan editorial majalah itu mengatakan bahawa mereka ingin membuat gambar ini dan gambar itu, jadi mereka melakukannya dengan terpinga-pinga.Beginilah cara orang-orang jahat itu dibuat!

Lebih dekat dengan rumah, prinsip pertama percubaan adalah untuk menentukanketegasan logik eksperimen.Perkara yang paling asas ialah reka bentuk eksperimen, dan perkara yang paling penting tentang reka bentuk eksperimen ialah cara menetapkan sampel sasaran, sampel rujukan (kawalan), dan bilangan ulangan, supaya data eksperimen boleh dirujuk, setanding, dan meyakinkan.

Sampel sasaranmerujuk kepada sampel yang memerlukan kita mengesan gen sasaran selepas rawatan tertentu.Sampel rujukanadalah sampel tanpa sebarang rawatan, yang sering dirujuk sebagai jenis liar dalam biologi.

Replika eksperimenadalah sangat penting.Secara amnya, bilangan replika persuasif mestilah lebih daripada tiga.Adalah perlu untuk membezakan apa itu replikasi biologi dan apa itu replikasi teknikal.

Replika Biologi: Percubaan pengesahan yang sama dilakukan dengan bahan yang berbeza (masa, tumbuhan, kelompok, plat tindak balas).

Penduaan biologi
Mari kita ambil rawatan racun perosak lada sebagai contoh.Kami ingin menyembur racun perosak pada tiga tumbuhan ABC, kemudian tiga tumbuhan ABC adalah tiga replika biologi, dan ia adalah eksperimen pengesahan yang sama yang dijalankan dengan bahan yang berbeza.Tetapi sebagai percubaan, kawalan pasti diperlukan, jadi kita boleh menyembur salah satu cabang tumbuhan A untuk membentuk kumpulan eksperimen tumbuhan A, dan tidak menyembur cawangan lain tumbuhan A untuk membentuk kumpulan kawalan.Lakukan perkara yang sama untuk B dan C.

Replika Teknikal (Replika Teknikal): Ia adalah percubaan berulang yang direka untuk mengelakkan ralat yang disebabkan oleh operasi, yang sebenarnya merupakan lubang pendua yang disertakan dalam bahan yang sama.Kedua-dua rawatan dan kawalan mesti mempunyai tetapan replika (minimum tiga) gen sasaran dan gen rujukan dalaman.

Pengulangan teknikal
Ambil lada yang dirawat dengan racun serangga sebagai contoh sekali lagi.Untuk kumpulan eksperimen tumbuhan A, kami membuat tiga lubang PCR 1, 2, dan 3 masing-masing untuk gen sasaran dan gen rujukan dalaman, untuk mengambil purata selepas pengesanan.Untuk kawalan tumbuhan A Kumpulan juga dirawat dengan cara yang sama.Begitu juga, lakukan rawatan yang sama untuk tumbuhan B dan C.Ini adalah pengulangan teknikal.

Perlu diperhatikan bahawaapa yang dimasukkan ke dalam statistik ialah pengulangan biologi, dan pengulangan teknikal adalah untuk menguji sama ada terdapat sebarang fenomena rawak dalam proses eksperimen, supaya membuat keputusan eksperimen boleh dipercayai, iaitu, untuk mengelakkan ralat dengan mengambil purata mereka seperti yang sering kita katakan.

Kawalan Negatif—NTC dan NRT
NTC (Kawalan Tanpa Templat), kawalan tanpa templat, digunakan untuk mengesahkan sama ada bahan eksperimen itu tercemar.Secara amnya, air digunakan sebagai templat.Sekiranya terdapat tindak balas pendarfluor, ia menunjukkan pencemaran asid nukleik telah berlaku di makmal.

Pencemaran ini datang daripada: air tidak tulen, reagen tidak berkelayakan yang mengandungi DNA endogen, pencemaran primer, pencemaran peralatan makmal, pencemaran aerosol, dsb., perlu menggunakan penghapus RNase dan perencat RNase.Pencemaran aerosol adalah yang paling sukar ditemui.Bayangkan makmal anda seperti asap, dengan pelbagai asid nukleik terampai di udara.

NRT (No-Reverse Transcriptase), kawalan tanpa transkripsi terbalik, ialah RNA transkripsi bukan songsang sebagai kawalan negatif, iaitu kawalan residu gDNA.

Apabila melakukan ekspresi gen, jumlah RNA dikesan dengan mengesan jumlah cDNA selepas transkripsi terbalik.Sekiranya terdapat sisa gDNA apabila RNA dimurnikan, ia akan menyebabkan ralat dalam keputusan eksperimen, kerana keputusan sebenar yang diperoleh adalah gDNA dan cDNA.Pada peringkat agregat, bukan sahaja cDNA, gDNA perlu dikeluarkan sepenuhnya semasa pengekstrakan RNA.

MIQE (2)—contoh maklumat
Maklumat sampel yang dipanggil bermakna apabila kami menerbitkan artikel tentang qPCR, kami mesti menerangkan maklumat sampel dengan jelas, yang merupakan bahagian penting dalam artikel itu.Begitu juga, apabila kita memproses sampel, kita juga mesti mengawal selia operasi kita sendiri untuk memastikan kesahihan sampel.

Penerangan sampel hanyalah hasil, dan kita harus memberi lebih perhatian kepada bahan yang diambil semasa keseluruhan eksperimen.

Pemilihan bahan eksperimen
Sampel darah – pilih darah segar, tidak lebih daripada 4 jam.Sampel sel – pilih untuk mengumpul sel segar dalam tempoh pertumbuhan yang cergas.Tisu Haiwan—Pilih tisu yang segar dan cergas tumbuh.Tisu Tumbuhan – Pilih tisu muda yang segar.

Anda pasti perasan bahawa terdapat kata kunci dalam beberapa ayat ini: segar .
Untuk sampel di atas, kit terbaik, kos efektif dan stabil di pasaran ialah kit Foregene, yang boleh mengekstrak DNA dan RNA mereka dengan cepat dan mudah.

Kit Mini DNA Darah

Kit Pengasingan RNA Jumlah Sel

Kit Pengasingan RNA Jumlah Haiwan

Kit Pengasingan RNA Jumlah Tumbuhan

Kit Pengasingan RNA Jumlah Tumbuhan Plus

Kit Pengasingan DNA Tumbuhan

Penyimpanan bahan eksperimen
Secara umumnya, kami tidak mengesyorkan menyimpan sampel, jika keadaan membenarkan.Walau bagaimanapun, terdapat ramai rakan yang tidak dapat menjalankan eksperimen serta-merta selepas pensampelan, malah ada yang perlu membawa tangki nitrogen cecair ke lapangan untuk pensampelan.

Untuk rakan yang bekerja keras seperti ini, saya hanya boleh mengatakan bahawa anda tidak memahami bahan habis pakai reagen.Kini banyak syarikat boleh guna reagen menghasilkan reagen yang boleh menyimpan sampel RNA pada suhu bilik, dan anda boleh memilih untuk menggunakannya.Kaedah penyimpanan konvensional ialah penyimpanan nitrogen cecair, menggunakan tangki nitrogen cecair kecil yang mudah dibawa.Selepas membawa kembali sampel ke makmal, simpan di dalam peti sejuk -80°C.

Untuk eksperimen yang melibatkan RNA, prinsip enam perkataan mesti diikuti:suhu rendah, tiada enzim,dancepat .

Konsep suhu rendah mudah difahami;tanpa enzim, RNase ada di mana-mana di dunia tempat kita tinggal (jika tidak anda akan dibunuh oleh HIV), jadi bagaimana untuk mengelakkan RNase apabila melakukan eksperimen adalah konsep yang sangat penting;cepat,Tidak ada Kung Fu di dunia yang tidak boleh dipecahkan, hanya kelajuan yang tidak boleh dipecahkan.

Oleh itu, dalam erti kata lain, lebih pendek masa pengekstrakan, lebih baik kit.MengapaForegeneKit ini menekankan kelajuan, kerana mereka mengetahuinya dengan baik.

PS: Sesetengah gadis melakukan eksperimen dengan sangat berhati-hati, tetapi mereka tidak sebaik slam dunk selepas beberapa tahun bekerja.Mereka merasakan bahawa Tuhan tidak adil, mengeluh tentang orang lain, dan mencari kehidupan.Sebenarnya, dia tidak memahaminya.Dia tidak melindungi RNA dengan baik, dan pemain slam dunk itu lincah.Semasa dia melakukan eksperimen, dia berfikir bahawa dia akan menghabiskan slam dunk dengan tiga kali, lima kali dan dua bahagian, tetapi dia melakukan eksperimen dengan baik.

Catatan: Lebih perlahan, lebih banyak peluang pencerobohan RNase.Bagaimana untuk melatih diri anda menjadi pantas?Tidak ada cara, hanya berlatih lebih banyak.

Untuk eksperimen yang berbeza dan sampel yang berbeza, masih perlu membaca lebih banyak literatur dan memilih kaedah yang sesuai untuk pemprosesan.Untuk proses pengumpulan dan penyimpanan sampel, MIQE menghendaki ia mesti ditulis dengan jelas dalam kertas, supaya penyemak boleh menyemak kebolehpercayaan kertas itu, dan ia juga mudah untuk anak-anak muda yang terpegun untuk mengulangi percubaan anda.

Walaupun eksperimen biologi sukar, ia adalah canggih.Jika anda tidak berhati-hati, anda boleh mengubah dunia.Contohnya, menjadikan SARS sebagai krisis biokimia, atau menjadikan beras hibrid untuk menyelamatkan 1.3 bilion orang.Gambar di bawah adalah eksperimen kimia, anda harus memahami betapa bangganya anda dengan penyelidikan anda hanya dengan melihat penampilannya yang seperti batang.Lupakan, jangan hitamkan dia.

MIQE (3) – pengekstrakan asid nukleik.
Pengekstrakan asid nukleik adalah peristiwa besar, dan semua eksperimen biologi molekul bermula dengan pengekstrakan asid nukleik.Pertama sekali, mari kita salin kandungan MIQE mengenai pengekstrakan asid nukleik.

Melihat borang ini, anda tidak boleh kekal di permukaan.Bentuknya adalah dogma.Untuk menjadi pelajar cemerlang, anda mesti bertanya mengapa.Kandungan penting jadual ini ialah: Kejarketulenan, integriti, konsistensi, dan jumlah pengekstrakan RNA .

Bahagian pertama daripadaproses atau instrumen ialah langkah pengekstrakan asid nukleik.Jika anda menggunakan pengekstrak asid nukleik automatik untuk mengekstrak (lanjutan, sila hubungi saya untuk pembelian), anda perlu menunjukkan nama model instrumen.

Nama kit dan

kit yang digunakan untuk butiran perubahan, reagen khas yang ditambahkan atau operasi khas yang dilakukan harus diterangkan dengan jelas supaya orang lain boleh mengulangi eksperimen anda dengan mudah.

Sesetengah orang menambah beberapa reagen khas apabila mengekstrak sampel khas, memikirkan bahawa ini adalah senjata rahsia mereka dan tidak memberitahu orang lain.Sambil merahsiakannya, mereka juga kehilangan peluang untuk menyerlahkan artikel anda.Jangan pandai-pandai, kena lebih jujur ​​dari Zhang tua negara dalam penyelidikan saintifik, kalau nak pandai, artikel tu buat bodoh.

mesti ingat nombor produk kitapabila anda memesan kit dan menulis artikel.Biasanya terdapat dua nombor pada kit: Cat—nombor katalog (nombor produk, nombor artikel), Lot—nombor lot produk ( Digunakan untuk menunjukkan kumpulan mana produk itu datang).

Di samping itu, nombor CAS sering digunakan semasa memesan reagen biokimia, dan saya akan mempopularkannya bersama-sama.Nombor CAS ialah nombor yang diberikan oleh American Chemical Society kepada setiap ubat kimia baharu.Secara amnya, tiga nombor disambungkan dengan sengkang.Nombor CAS Rushui: 7732-18-5.Bahan kimia selalunya mempunyai berbilang alias, tetapi nombor CAS adalah unik.Apabila memesan ubat, anda boleh menyemak nombor CASnya terlebih dahulu.

Lebih dekat dengan rumah, mengapa kita perlu menerangkan perkara ini dengan jelas?Malah, ia juga untuk memeriksa kualiti pengekstrakan RNA.Penggunaan instrumen dan kit akan menjadikan pengekstrakan RNA lebih konsisten.Skala pengekstrakan makmal biasa tidak besar, dan ia boleh diperolehi dengan kit.

Butiran rawatan DNase atau RNase
Isu penting PCR kuantitatif pendarfluor adalah untuk mencegah pencemaran DNA, dan jangan mencuba jika terdapat pencemaran.Oleh itu, adalah penting untuk menyatakan proses yang anda gunakan untuk memproses DNA, untuk menunjukkan bahawa DNA dalam proses eksperimen telah dikeluarkan sepenuhnya dan sepenuhnya.diwakili oleh gambarajah skematik.

Gambar rajah skema RNA dan DNA
Secara umum, kaedah untuk mengeluarkan DNA adalah untuk merawat RNA dengan DNase selepas pengekstrakan.Walau bagaimanapun, ini adalah kaedah yang agak lama.Kit pengekstrakan RNA komersial telah dapat mengeluarkan DNA semasa proses pengekstrakan tanpa menambah DNase .Contohnya, satu siri kit daripada Foregene .

Catatan: Mengeluarkan DNA semasa pengekstrakan RNA adalah pedang bermata dua yang sangat berbahaya, yang akan memanjangkan masa operasi pengekstrakan RNA dan meningkatkan risiko degradasi RNA.Pada asasnya, ia adalah pertukaran antara hasil RNA dan ketulenan.

Di samping itu, jumlah DNase yang ditambahkan pada lajur penjerapan berasaskan silika adalah sangat kecil, dan DNase berkualiti tinggi mesti digunakan untuk mencapai kesannya.DNase yang tidak dioptimumkan tidak boleh dihadam dengan cepat dan sepenuhnya.Ini adalah ujian tahap teknikal pedagang.Sudah tentu, terdapat lebih banyak peniaga pelik yang bermegah bahawa DNA boleh dikeluarkan tanpa DNase.Boleh dikatakan sesiapa yang mendabik dada bahawa DNA boleh dibuang sepenuhnya tanpa DNase adalah hooligan.DNA adalah struktur untaian dua yang agak stabil, dan ia tidak boleh dihapuskan hanya dengan bercakap dan ketawa.

Penilaian pencemaran
kaedah penilaian: pengesanan elektroforesis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, memuatkan 1-3 ul

Analisis kuantitatif asid nukleik
biasanya diukur menggunakan spektrofotometer UV.Izinkan saya mempopularkan dahulu maksud tiga nilai OD260, OD280 dan OD230.
·OD260nm: Ia adalah panjang gelombang penyerapan puncak penyerapan tertinggi asid nukleik, dan nilai terukur terbaik berjulat dari 0.1 hingga 1.0.Jika tidak, cairkan atau tumpukan sampel untuk membawanya dalam julat.
·OD280nm: Ia adalah panjang gelombang penyerapan puncak penyerapan tertinggi protein dan bahan fenolik.
·OD230nm: Ia adalah panjang gelombang penyerapan puncak penyerapan tertinggi karbohidrat.

Seterusnya, mari kita bercakap tentang peranan setiap penunjuk.Untuk A260, ia boleh digunakan untuk mengukur hasil asid nukleik.Apabila OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Untuk ketulenan, kita perlu melihat nisbah yang biasa kita lihat: OD260/280 dan OD260/230.
·DNA tulen: OD260/280 adalah lebih kurang sama dengan 1.8.Apabila ia lebih daripada 1.9, ia menunjukkan bahawa terdapat pencemaran RNA, dan apabila ia kurang daripada 1.6, ia menunjukkan bahawa terdapat pencemaran protein dan fenol.
·RNA tulen: 1.7
·OD260/230: Sama ada DNA atau RNA, nilai rujukan ialah 2.5.Apabila kurang daripada 2.0, ia menunjukkan bahawa terdapat pencemaran gula, garam dan bahan organik.

Integriti RNA

Ia sangat penting untuk mengukur integriti RNA.Secara amnya, adalah perlu untuk melakukan eksperimen gel denaturasi RNA untuk memeriksa sama ada kecerahan antara RNA 28S dan 18S ialah hubungan dua kali ganda.Apabila jalur ketiga 5S muncul, ini bermakna RNA telah mula merosot, kecuali invertebrata.

Data untuk penilaian kualiti RNA: Sebagai tambahan kepada ujian di atas, terdapat juga beberapa ujian instrumen yang lebih maju dari segi integriti RNA, seperti ujian integriti RQI sistem elektroforesis automatik Experion, yang boleh mengesan sama ada RNA terdegradasi secara tidak kelihatan.

Dalam penyelidikan saintifik, PCR kuantitatif pendarfluor adalah perbandingan antara gen sasaran dan gen rujukan dalaman.Oleh itu, dalam proses pemeliharaan sampel RNA, pengekstrakan RNA, dan lain-lain, matlamat utama adalah untuk memastikan integriti RNA .

Bagaimana integriti RNA mempengaruhi keseimbangan antara gen sasaran dan gen rujukan dalaman boleh difahami dengan mudah daripada rajah di bawah.Degradasi akan membawa kepada ketidaklengkapan gen, sama ada ketidaklengkapan gen rujukan dalaman atau ketidaklengkapan gen sasaran, ia akan memberi kesan yang besar kepada data.

Gambarajah skematik gen sasaran dan gen rujukan, mestilah tidak benar

Ujian perencatan (sama ada nilai CT ditindas di bawah kepekatan tinggi atau rendah atau keadaan lain)

Mengambil angka ini sebagai contoh, nilai Ct bagi lima lengkung adalah seperti berikut.Taburan nilai CT antara lengkung adalah tidak sekata, dan nilai Ct ditangguhkan di bawah kepekatan tinggi dan rendah, iaitu kes perencatan PCR.

Perkara utama: Dalam proses pengekstrakan RNA, kita perlu meninggalkan salah tanggapan dan mewujudkan yang betul.

Idea yang salah ialah: Pengekstrakan RNA hanya mengejar hasil, memikirkan bahawa semakin besar jumlah RNA yang diperoleh, semakin baik.Sebenarnya, apabila kita melakukan kuantifikasi, jika bilangan gen tidak begitu besar, kita tidak memerlukan banyak RNA.Jumlah RNA yang anda ekstrak adalah lebih daripada mencukupi.

Konsep yang betul ialah:Pengekstrakan RNA harus mengejar ketulenan, integriti dan konsistensi.Ketulenan boleh memastikan bahawa transkripsi terbalik seterusnya tidak dihalang dan data tidak akan terjejas oleh DNA.Integriti memastikan keseimbangan urutan sasaran dan rujukan dalaman.Ketekalan memastikan pemuatan sampel yang stabil.

MIQE (4) – transkripsi terbalik
Salah tanggapan: mengejar volum sampel yang lebih tinggi.
Konsep yang betul: Mengejar konsistensi (kestabilan), tanpa mengira jumlah RNA yang dimuatkan, kecekapan transkripsi terbalik kekal konsisten, memastikan bahawa perbezaan dalam cDNA benar-benar dapat mencerminkan perbezaan dalam mRNA.
Kami menerangkan proses ini dengan gambarajah skematik:

Gambarajah skematik kecekapan transkripsi terbalik, tidak benar
Pertama sekali, kita perlu memahami perbezaan antara proses transkripsi terbalik dan proses PCR.PCR menjalani pelbagai proses pemanasan dan penyepuhlindapan, dan serpihan sasaran berkembang dengan pesat;manakala transkripsi terbalik tidak mempunyai proses ini, kita boleh bayangkan bahawa transkripsi terbalik sebenarnya adalah satu sama satu Semasa proses replikasi, seberapa banyak kepingan RNA

kerana terdapat boleh mendapatkan seberapa banyak maklumat cDNA, ia harus difahami sekarang, kerana serpihan besar dan kecil telah ditranskripsikan secara terbalik, dan adalah mustahil untuk menumpukan pada satu serpihan.Dan kerana jumlah RNA agak kecil, jumlah cDNA yang diperoleh juga agak kecil, tidak seperti PCR, yang mempunyai kesan amplifikasi, jadi pada dasarnya mustahil untuk dikesan.

keputusan elektroforesis cDNA
Kedua, secara idealnya, transkripsi terbalik dilakukan satu-satu, tetapi tiada transkripase terbalik daripada mana-mana syarikat boleh mencapai kesan ini.Pada asasnya, kecekapan kebanyakan transkripase terbalik mengembara antara 30-50%.Jika ini berlaku, kami lebih suka mempunyai kecekapan transkripsi songsang yang agak stabil, iaitu apa yang kami mahu lihat dalam rajah: 3 RNA mendapat 2 cDNA, 6 RNA mendapat 4 cDNA, jadi tidak kira berapa banyak sampel yang dimuatkan , kecekapan transkripsi terbalik adalah agak stabil.Kami tidak mahu melihat keadaan di mana kecekapan transkripsi terbalik tidak stabil dan kepekatan tinggi dihalang.

Jadi, bagaimana untuk mengesahkan sama ada kecekapan transkripsi terbalik adalah stabil?Kaedahnya sangat mudah, anda hanya perlu melakukan ujian perbandingan: satu adalah untuk menyalin balik ke dalam cDNA selepas dua kali ganda pencairan RNA, dan yang lain adalah untuk membuat dua kali ganda pencairan selepas transkripsi terbalik ke dalam cDNA, dan kemudian lakukan qPCR untuk melihat cerun yang diperolehi Adakah ia konsisten.Sebagai pelajar terbaik, anda harus memahaminya dalam beberapa saat.Seperti yang ditunjukkan di bawah:

Pencairan RNA dan cDNA untuk menguji sama ada kecekapan transkripsi terbalik adalah stabil
Transkripase terbalik dan kit
Bagaimanakah PCR kuantitatif pendarfluor yang sempurna mempunyai transkripase dan kit terbalik yang sangat baik.Reverse transcriptase dibahagikan secara kasar kepada dua jenis mengikut sumber, AMV atauM-MLV, dan prestasi mereka adalah sama seperti yang ditunjukkan dalam jadual.

Aktiviti RNase H
RNase H ialah Ribonuclease H, nama Cina ialah ribonuclease H, iaitu endoribonuclease yang secara khusus boleh menghidrolisis RNA dalam rantai hibrid DNA-RNA.RNase H tidak boleh menghidrolisis ikatan fosfodiester dalam DNA atau RNA untai tunggal atau dua untai, iaitu, ia tidak boleh mencerna DNA atau RNA untai tunggal atau untai ganda.Biasa digunakan dalam sintesis untaian kedua cDNA.

Ia satu perkara yang pelik.Kami mengatakan bahawa transkripase terbalik mempunyai aktiviti RNase H, bukan bahawa transkripase terbalik mengandungi RNase H, dan mungkin tidak mungkin untuk memisahkan RNase H daripada transkripase terbalik, mungkin kerana konformasi kumpulan tertentu dalam transkripase terbalik Aktiviti ini disebabkan oleh transkripase terbalik.

Oleh itu, tanpa mengira kecekapan transkripsi terbalik AMV yang lebih tinggi, aktiviti RNase Hnya mengurangkan hasil cDNA.Sudah tentu, pengeluar reagen sentiasa mengoptimumkan produk mereka untuk menghapuskan aktiviti RNase H dalam transkripase terbalik sebanyak mungkin untuk meningkatkan hasil cDNA.
Suhu penyepuhlindapan

Struktur sekunder RNA pada suhu yang berbeza
Lihat rajah di atas untuk struktur sekunder RNA pada suhu yang berbeza, dan gunakan alat dalam talian mFold untuk menentukan struktur sekunder serpihan sasaran di bawah suhu tertentu dan keadaan kepekatan garam.Pada 55 ° C, struktur sekunder RNA masih sangat kompleks, transkripase terbalik tidak dapat berfungsi, dan struktur sekunder tidak dapat diselesaikan sepenuhnya sehingga 65 ° C, manakala suhu optimum AMV dan M-MLV jauh lebih rendah daripada suhu ini.
Apa nak buat?Struktur sekunder ialah gandingan pelengkap templat itu sendiri, yang membawa kepada persaingan yang kuat antara primer dan transkripase terbalik dan templat, mengakibatkan satu siri masalah seperti E rendah dan kebolehulangan yang lemah.

Apa nak buat?Hanya tingkatkan suhu penyepuhlindapan sebanyak mungkin.

Banyak pengeluar reagen meningkatkan transkripase terbalik mereka melalui kejuruteraan genetik.Ada yang meningkatkan suhu tindak balas, seperti Jifan dan Aidelai, dan ada yang mengeluarkan kumpulan aktif enzim RNase H untuk meningkatkan pertalian antara enzim dan templat RNA.Perkaitan tinggi boleh memerah secara kompetitif struktur sekunder dan membaca dengan lancar, dan juga meningkatkan kecekapan transkripsi terbalik.
Perkara utama: Transkripsi songsang adalah lebih penting untuk mengejar konsistensi kecekapan transkripsi songsang (enzim bukan sahaja mesti cekap tetapi juga stabil), berbanding jumlah sampel yang dimuatkan, jika ia bukan PCR kuantitatif pendarfluor berskala besar, ia tidak akan dapat dilakukan sama sekali.Berbilang cDNA.
Pelbagai pengeluar juga telah melakukan beberapa usaha dalam usaha mencapai konsistensi.Sebagai contoh, kebanyakan syarikat kini telah membungkus transkripsi terbalik sebagai kit standard untuk dijual, yang merupakan pilihan yang baik.
Sebagai contoh, kit Siri Mudah RT Foregene:

RT Easy I(Pracampuran induk untuk kit sintesis cDNA untai pertama)

MIQE (5) – maklumat gen sasaran

Rajah di atas menerangkan
1. Sama ada gen ini berkesan untuk eksperimen berulang secara amnya boleh disahkan dengan eksperimen berulang.
2. ID gen, anda tahu.
3. Panjang gen, jumlah panjang gen sasaran pastinya tiada masalah.Semasa mereka bentuk primer, pastikan panjang amplikon adalah antara 80-200bp untuk memastikan kecekapan amplifikasi yang lebih baik.
4. Maklumat perbandingan Letupan Jujukan, gen sasaran perlu dibandingkan dalam bank gen untuk mengelakkan penguatan tidak spesifik.
5. Kehadiran pseudogenes.Pseudogene ialah urutan DNA yang serupa dengan gen biasa tetapi kehilangan fungsi normalnya.Ia sering wujud dalam keluarga multi-gen eukariota.Ia biasanya diwakili oleh ψ.Ia adalah salinan DNA genomik tidak berfungsi dalam genom yang sangat serupa dengan urutan gen pengekodan., secara amnya tidak ditranskripsikan, dan tidak mempunyai makna fisiologi yang jelas.
6. Kedudukan primer berbanding dengan ekson dan intron.Pada tahun-tahun awal, apabila kami menyelesaikan masalah pencemaran DNA, kami sering memberi perhatian kepada kedudukan primer, ekson, dan intron, dan secara amnya mempertimbangkan mereka bentuk primer merentas intron untuk mengelakkan penguatan DNA.Sila lihat rajah di bawah: hitam mewakili intron, pelbagai biru mewakili ekson, merah jambu mewakili primer biasa, dan merah terang mewakili primer merentangi intron.

Skema, tidak pernah benar
Sungguh rancangan yang sempurna ini nampaknya, tetapi sebenarnya, dalam kebanyakan kes, primer trans-intron tidaklah ajaib seperti yang dibayangkan, dan ia juga akan menyebabkan penguatan tidak spesifik.Jadi cara terbaik untuk mengelakkan pencemaran DNA adalah dengan membuang DNA sepenuhnya.
7. Ramalan konformasi.Menggunakan contoh ini sekali lagi, gunakan alat dalam talian mFold untuk menentukan struktur sekunder serpihan sasaran pada suhu dan kepekatan garam tertentu.

Struktur sekunder RNA pada suhu yang berbeza
Struktur sekunder ialah gandingan pelengkap templat itu sendiri, yang akan membawa kepada persaingan yang kuat antara pasangan primer dan templat, dan peluang pengikatan primer adalah kurang, mengakibatkan beberapa siri masalah seperti E rendah dan kebolehulangan yang lemah.Melalui ramalan perisian, jika tiada masalah struktur sekunder, itu bagus.Jika ada, artikel susulan kami akan membincangkan secara khusus cara menyelesaikan masalah ini.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

Untuk PCR kuantitatif pendarfluor, perkara pertama yang anda hadapi setiap hari ialah pengekstrakan RNA, dan perkara kedua mungkin reka bentuk primer.
Pertama sekali, kami masih menyemak peraturan tentang reka bentuk primer mengikut senarai semak MIQE.Ia sangat mudah sehingga orang jahat boleh ketawa, dan kita boleh menyelesaikannya dalam satu ayat: ketahui urutan dan kedudukan kuar primer dan kaedah pengubahsuaian.Untuk kaedah penulenan primer, sintesis primer sangat murah pada masa ini, qPCR layak menggunakan kaedah penulenan PAGE dan di atas, dan maklumat instrumen sintesis tidak penting.Ramai orang telah melakukan primer selama beberapa dekad dan tidak tahu bahawa synthesizer adalah ABI3900.
Mengenai prinsip reka bentuk primer, anda tidak perlu menghafalnya secara hafalan, kerana kebanyakan perisian reka bentuk primer atau alat dalam talian boleh menangani masalah ini (alat dalam talian yang disyorkan primer3.ut.ee/), dan 99.999% reka bentuk primer tidak dilakukan secara manual Lihat, penulis kadang-kadang mereka bentuk ratusan buku asas sehari, jika anda membaca satu persatu, ia akan menjadi bersila.
Hanya semak perkara berikut selepas primer direka bentuk:
1. Reka bentuk primer hampir dengan hujung 3′: Dalam kes menggunakan primer oligo dT untuk sintesis untai pertama cDNA, dengan mengambil kira kecekapan transkripsi terbalik dan integriti RNA, primer yang direka bentuk perlu direka bentuk hampir dengan hujung 3′ untuk meningkatkan kecekapan penguatan .Gunakan gambar untuk menerangkan seperti berikut (tiada cara untuk memahami ini):

Mengapa buku asas perlu direka hampir dengan hujung 3′, ia mesti tidak benar
2. Nilai TM: Nilai Tm adalah pada 55-65°C (kerana aktiviti exonuclease adalah yang tertinggi pada 60°C), dan kandungan GC adalah pada 40%-60%.
3. BLAST: Untuk mengelakkan penguatan genom yang tidak spesifik, Blast mesti digunakan untuk pengesahan tambahan.

MIQE(7)—proses qPCR

1. kit qPCR
Mengikut keperluan MIQE, kita mesti menerangkan dengan jelas keadaan tindak balas yang lengkap dalam artikel, termasuk konfigurasi sistem tindak balas PCR, kit apa yang digunakan, siapa pengilang, berapa besar sistem tindak balas, sama ada kaedah pewarna atau kaedah siasatan digunakan, tetapan program PCR.Pemandu veteran pasti akan mendapati bahawa selagi kit dipilih, maklumat di atas pada dasarnya ditentukan.
Pada masa ini, pembuatan dan pengeluaran kit PCR kuantitatif pendarfluor adalah teknologi yang sangat matang.Selagi anda tidak memilih pengeluar yang sangat teruk, kebarangkalian masalah tidak tinggi, tetapi kami masih ingin berkongsi dengan anda beberapa perkara:
Enzim Taq permulaan panas:Bahagian terpenting PCR ialah enzim Taq permulaan panas.Enzim permulaan panas di pasaran biasanya dibahagikan kepada dua jenis, satu ialah enzim permulaan panas yang diubah suai secara kimia (anda boleh bayangkan ia sebagai pembenaman parafin), dan satu lagi ialah Enzim permulaan panas untuk pengubahsuaian antibodi (pengikatan antigen-antibodi).Pengubahsuaian kimia ialah cara awal enzim mula panas.Apabila suhu tertentu dicapai, enzim akan melepaskan aktivitinya.Enzim permulaan panas yang diubah suai antibodi menggunakan kaedah biologi untuk menyekat aktiviti enzim.Apabila suhu tertentu dicapai, antibodi akan didenaturasi dan dinyahaktifkan sebagai protein, dan aktiviti enzim akan dimainkan.

Namun, apakah kegunaan ini?Ini adalah kesnya, aktiviti pelepasan enzim yang diubah suai antibodi adalah lebih cepat daripada enzim yang diubah suai secara kimia, jadi dari segi kepekaan, enzim yang diubah suai antibodi mempunyai sedikit kelebihan, jadi pada dasarnya tiada enzim yang diubah suai secara kimia dalam kit di pasaran.Jika ada, maka teknologi pengeluar ini masih terperangkap dalam era milenium.
Kepekatan ion magnesium:Kepekatan ion magnesium sangat penting dalam tindak balas PCR.Kepekatan ion magnesium yang sesuai boleh menggalakkan pembebasan aktiviti enzim Taq.Jika kepekatan terlalu rendah, aktiviti enzim akan berkurangan dengan ketara;jika kepekatan terlalu tinggi, penguatan bukan spesifik yang dimangkinkan enzim akan dipertingkatkan.Kepekatan ion magnesium juga akan mempengaruhi penyepuhlindapan primer, suhu lebur templat dan produk PCR, dengan itu menjejaskan hasil serpihan yang dikuatkan.Kepekatan ion magnesium secara amnya dikawal pada 25mM.Sudah tentu, untuk kit yang baik, kepekatan ion magnesium mesti dikawal dengan baik.Sesetengah peniaga menambah agen pengkelat ion magnesium kepada reagen, yang boleh mencapai kesan pelarasan automatik kepekatan ion magnesium.
Kepekatan pewarna pendarfluor:Pewarna pendarfluor, iaitu SYBR Green yang biasa kita gunakan, terutamanya menjana pendarfluor dengan mengikat pada alur kecil DNA untai dua, kerana pengikatan pewarna kepada DNA untai dua adalah tidak spesifik, iaitu selagi DNA untai dua digabungkan dengannya, pendarfluor boleh berlaku dalam templat DNA, jadi ia akan membentuk satu templat DNA, jadi ia akan bergabung dengan templat latar belakang.
PS: Disebabkan sifat peka cahayanya, produk di pasaran biasanya dibungkus dalam tiub empar legap coklat (seperti yang ditunjukkan dalam gambar di bawah).Walau bagaimanapun, ini akan menghadapi masalah.Sukar untuk melihat sama ada cecair disedut semasa pensampelan.Dalam hal ini, Qingke sememangnya paling mesra pengguna (seperti yang ditunjukkan dalam gambar di bawah), dan tiub lutsinar dibungkus dalam beg timah legap.Kemudian masukkannya ke dalam beg timah, dengan mengambil kira kemudahan untuk mengelakkan cahaya dan pensampelan.Anda mesti memilih nombor produk yang betul.TSE204 ialah kewujudan yang sangat kos efektif, yang membuatkan saya ingin menanam rumput.

Kepekatan pewarna pendarfluor juga sangat penting.Jika kepekatan terlalu rendah, lengkung amplifikasi tidak akan naik pada peringkat kemudian dan tidak sempurna;jika kepekatan terlalu tinggi, ia akan menyebabkan gangguan bunyi.Oleh kerana PCR kuantitatif pendarfluor terutamanya bergantung pada nilai CT, jika kepekatan pewarna pendarfluor tidak diselaraskan dengan betul, titik rendah adalah lebih baik daripada titik tinggi.Sudah tentu, kepekatan pewarna yang sesuai adalah yang terbaik.

ROX: Pewarna ROX digunakan untuk membetulkan ralat isyarat pendarfluor well-to-well.Sesetengah pengeluar instrumen memerlukan penentukuran, manakala yang lain tidak.Contohnya, penggunaan instrumen amplifikasi PCR Masa Nyata Thermo Fisher Scientific biasanya memerlukan penentukuran, termasuk 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, dll. Arahan kit am akan menerangkannya.
Campuran qPCR Foregene juga mengandungi pewarna ROX, yang mudah digunakan dalam pelbagai model.

PCR Kit-Taqman Masa Nyata

Rawatan ikatan hidrogen yang lemah: Rawatan ikatan hidrogen yang lemah adalah perkara yang agak teknikal.Tiada yang telah membaca manual banyak kit, tetapi tiada seorang pun daripada mereka yang menyebut topik ini.Malah, ia sangat penting.Gabungan asas bergantung terutamanya kepada kekuatan ikatan hidrogen.Ikatan hidrogen yang kuat adalah penguatan normal, dan ikatan hidrogen yang lemah membawa kepada penguatan tidak spesifik.Jika ikatan hidrogen yang lemah tidak dapat disingkirkan dengan baik, penguatan bukan spesifik tidak dapat dielakkan.Dalam skop penulis, hanya beberapa syarikat yang menyedari masalah ini.Apabila anda membeli kit, anda boleh merujuk sama ada anda telah mempertimbangkan penyelesaian dalam hal ini untuk kit yang anda ingin pilih.

Isipadu tindak balas: Sistem 20-50ul lebih biasa digunakan, dan volum yang lebih kecil berkemungkinan menyebabkan ralat.Secara umumnya, arahan kit akan mengesyorkan penggunaan jumlah tindak balas PCR.Jangan bijak dan gunakan volum yang lebih kecil untuk menjimatkan kos.matlamat.Jumlah yang disyorkan oleh peniaga sebenarnya telah diuji, dan mungkin mereka tidak dapat menyelesaikan masalah ralat yang disebabkan oleh jumlah yang kecil.
2. Nombor pengilang dan artikel plat tiub
Semua orang tahu prinsip PCR kuantitatif pendarfluor.Pengumpulan pendarfluor terutamanya dijalankan melalui penutup tiub PCR.Apabila memilih bahan habis pakai PCR, perhatikan dua perkara: penghantaran cahaya yang baik dan sesuai untuk instrumen.Secara umumnya, papan dan tiub jenama arus perdana adalah baik, tetapi anda perlu memilih dengan teliti dari segi penyesuaian, jika tidak, anda tidak akan dapat menggunakan instrumen tersebut.

4. Pengetahuan peringkat atasan

MIQE (8)—pengesahan qPCR
Ini adalah keutamaan qPCR!Begitu ramai hero telah jatuh ke dalam pasir di sini.Sudah tentu, mungkin juga anda bertuah dan gen yang anda kaji adalah mudah, jadi anda terapung melalui gua ais di sepanjang angin.Maklumat pengesahan qPCR bertujuan untuk menguji kebolehpercayaan data.Kami menyenaraikan maklumat pengesahan yang diperlukan seperti berikut:

1.Ujian kekhususan
Kekhususan amplifikasi gen sasaran diuji dengan memeriksa sama ada gambar elektroforesis adalah jalur tunggal;pengesahan jujukan;lengkung lebur untuk melihat sama ada peta puncak adalah tunggal;pengesahan pencernaan enzim dan kaedah lain.
Di sini, kami memberi tumpuan kepada tanalisis penguatan bukan spesifik menggunakan kaedah lengkung lebur.Secara umumnya, apabila kami mereka bentuk primer, saiz serpihan produk dikehendaki berada dalam julat 80-200bp, yang menjadikan suhu lebur produk PCR julat 80-85 °C.Oleh itu, jika terdapat pelbagai puncak, mesti ada produk penguatan bukan khusus yang lain;jika puncak muncul di bawah 80°C, ia biasanya dianggap sebagai dimer primer;jika puncak muncul melebihi 85°C, ia secara amnya dianggap sebagai pencemaran DNA atau lebih penguatan Tidak spesifik serpihan besar.
Nota: Kadangkala hanya terdapat satu puncak pada 80°C.Pada masa ini, konsep ini mesti dipatuhi.Kemungkinan hasil penguatan adalah semua dimer primer.

Lengkung lebur biasa (puncak tunggal tanpa amplifikasi bukan khusus)

Keluk lebur bermasalah (penguatan bukan khusus bagi puncak palsu)
【Analisis kes】

Terdapat puncak utama, tetapi dimer primer adalah serius
Keluk lebur puncak tunggal dalam rajah di bawah boleh memperdayakan mata anda dengan mudah, memikirkan ia adalah percubaan yang sempurna, tetapi hasilnya adalah salah sama sekali.Pada masa ini, kita perlu melihat suhu lebur.Suhu puncak adalah di bawah 80°C, yang sepenuhnya primer-dimer.

Tiada serpihan sasaran, semua dimer primer
Di sini, abang saya tidak boleh berhenti.Gambar di bawah adalah gambar yang diambil dengan telefon bimbit yang dihantar kepada saya oleh seorang scumbag.Reagen yang dia gunakan semuanya adalah jenama yang biasa digunakan dalam industri.Dia menukar daripada satu jenama awalan-T kepada jenama awalan-T yang lain.Saya rasa anda sudah menekanya.Bajingan itu menangis kepada saya: “Reagen yang digunakan dalam gambar pertama terlalu bagus, dan puncaknya adalah tunggal.Kemudian, selepas menggunakan reagen yang anda cadangkan, ia menjadi seperti gambar kedua, dengan puncak bercampur.Anda telah membuat saya sengsara.“
Pisahkan kedua-dua graf.Pada pandangan pertama, satu mempunyai puncak tunggal, dan satu lagi mempunyai puncak berganda.Mengarut, satu puncak sudah tentu baik.Adakah itu benar?
Lagi teruk dari Dou E, kalau saya letak dua gambar dalam gambar bawah ni, korang akan faham serta merta.Sebenarnya kita mudah lumpuh dengan gambar sebegini.Selepas analisis yang teliti, kami mendapati bahawa: puncak angka pertama adalah pada 75°C, iaitu dimer primer sepenuhnya;puncak angka kedua muncul pada 75°C dan 82°C, sekurang-kurangnya terdapat Produk muncul.

Gambar maklum balas daripada pelajar
Jadi masalah asas bukanlah masalah reagen, tetapi masalah reka bentuk primer.Pada masa yang sama, ia juga membuktikan bahawa beberapa jenama besar tidak berkualiti besi, dan ia juga membuktikan apa yang abang saya katakan sebelum ini: Bukan jenama reagen yang menyokong artikel anda.Ia adalah artikel anda yang menyokong jenama reagen.Cuba bayangkan, jika scumbag tidak menukar reagen, data yang salah akan dihantar ke jurnal, dan apa yang akan berlaku adalah tragedi.
2. Nilai Ct kawalan kosong
Jangan jelaskan, jika kawalan kosong mempunyai nilai Ct, bukankah ia pencemaran?Walau bagaimanapun, anda masih perlu memahami kawalan kosong yang mempunyai nilai Ct.Jika NTC, bermakna terdapat DNA asing seperti pencemaran reagen.Jika NRT, bermakna RNA yang diekstrak mempunyai pencemaran DNA.
3. Keluk piawai
Termasuk formula cerun dan pengiraan, kecekapan PCR boleh dikira melalui formula.Percubaan sempurna memerlukan kecerunan lengkung piawai untuk menghampiri 3.32, dan R² untuk menghampiri 0.9999.
4. Julat dinamik linear
Julat dinamik tindak balas adalah linear.Mengikut templat yang digunakan untuk menjana lengkung piawai, julat dinamik harus merangkumi sekurang-kurangnya 5 kecerunan kepekatan, dan memberi perhatian kepada perubahan nilai Ct pada kecerunan kepekatan tinggi dan kecerunan kepekatan rendah.
5. Ketepatan pengesanan
Perubahan dalam keputusan qPCR, iaitu, kebolehulangan yang lemah, iaitu, ketepatan yang lemah, disebabkan oleh banyak faktor, termasuk suhu, kepekatan dan operasi.Ketepatan qPCR biasanya menjadi kurang terkawal apabila nombor salinan berkurangan.Sebaik-baiknya variasi dalam eksperimen, variasi teknikal ini harus berbeza daripada variasi biologi, dan replika biologi boleh secara langsung menangani perbezaan statistik dalam keputusan qPCR antara kumpulan atau rawatan.Khususnya untuk ujian diagnostik, ketepatan antara ujian terbaik (kebolehulangan) merentas tapak dan pengendali mesti dilaporkan.
6. Kecekapan pengesanan dan LOD (dalam qPCR multipleks)
LOD ialah kepekatan terendah sebanyak 95% sampel positif yang dikesan.Dalam erti kata lain, kepekatan LOD yang terkandung dalam satu set replikasi gen sasaran tidak boleh melebihi 5% daripada tindak balas yang gagal.Apabila melakukan analisis qPCR multipleks, terutamanya untuk pengesanan serentak mutasi titik atau polimorfisme, qPCR multipleks perlu memberikan bukti bahawa ketepatan berbilang serpihan sasaran tidak terjejas dalam tiub yang sama, pengesanan berbilang dan pengesanan tiub tunggal Kecekapan dan LOD harus sama.Terutama apabila gen sasaran kepekatan tinggi dan gen sasaran kepekatan rendah dikuatkan secara serentak, masalah ini mesti diberi perhatian.
Masalah dan penyelesaianSecara umumnya, masalah yang sering dihadapi dalam penyahpepijatan qPCR memfokuskan pada aspek berikut:
· penguatan tidak spesifik
·Pilihan kepekatan primer yang sukar dan masalah dengan dimer primer
·Suhu penyepuhlindapan tidak tepat
·Struktur sekunder menjejaskan kecekapan amplifikasi
penguatan tidak spesifik
penguatan bukan spesifikberlaku , secara amnya dipertimbangkan sama ada reka bentuk primer tidak sesuai, tetapi jika anda tidak tergesa-gesa untuk menukar primer, anda boleh mencuba kaedah berikut terlebih dahulu (prinsipnya juga dilampirkan):
·Tingkatkan suhu penyepuhlindapan – cuba buat ikatan hidrogen yang lemah tidak dapat dikekalkan;
·Memendekkan masa penyepuhlindapan dan pemanjangan – mengurangkan kemungkinan ikatan hidrogen yang lemah;
·Kurangkan kepekatan primer – mengurangkan peluang pengikatan primer berlebihan dan kawasan bukan sasaran;
Kecekapan amplifikasi yang rendah
Keadaan yang bertentangan dengan penguatan bukan khusus – kecekapan penguatan rendah, dan langkah-langkah untuk menangani kecekapan penguatan rendah adalah sebaliknya:
· Memanjangkan masa penyepuhlindapan dan pemanjangan;
·Tukar kepada PCR tiga langkah dan kurangkan suhu penyepuhlindapan;
·Meningkatkan kepekatan primer;
Ps: Ramai pelajar siswazah yang lahir pada tahun 90-an tidak bersedia untuk mengkaji bagaimana untuk menyahpepijat eksperimen, dan berharap kit itu dapat menyelesaikan masalah sepenuhnya (jika anda ingin pergi ke syarikat reagen untuk melakukan penyelidikan dan pembangunan selepas tamat pengajian), sebenarnya, pengilang reagen juga berfikir seperti ini, saya harap ia adalah bodoh Ia boleh digunakan apabila anda mendapatkannya, jadi pengilang tidak memerlukan banyak usaha untuk menyelesaikan masalah ini, termasuk banyak usaha untuk menyelesaikan masalah ini. faktor penyerapan ikatan H yang lemah.Untuk menyelesaikan masalah dengan mudah, orang bodoh masih perlu membaca pengenalan syarikat reagen untuk melihat sama ada terdapat faktor yang menyerap ikatan hidrogen yang lemah.
Pilihan kepekatan primer yang sukar dan masalah dengan dimer primer
Kaedah 1: Secara umumnya, arahan kit untuk qPCR mempunyai sistem yang disyorkan dan kepekatan primer yang disyorkan.
Kaedah 2: Penyahpepijatan dengan menetapkan kecerunan kepekatan primer.Gambar di bawah dicuri daripada sebuah syarikat untuk menggambarkan.Rajah di bawah menunjukkan keputusan kuantitatif pendarfluor yang dibuat dengan tiga kecerunan kepekatan primer (100nM, 250nM, 500nM) dan empat kecerunan kepekatan templat (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Nilai Ct keputusan eksperimen diplotkan seperti berikut:

Pemilihan Kepekatan Primer Gabungkan setiap kepekatan primer ke dalam satu baris seperti berikut:

Pilihan kepekatan primer adalah jelas, hubungan linear kepekatan primer 100nM dan 250nM adalah lebih baik, dan hubungan linear kepekatan primer 500nM adalah agak lemah.Dalam 100nM dan 250nM, nilai Ct 250nM adalah agak kecil, jadi kepekatan primer yang optimum ialah 250nM.Secara amnya primer-dimer yang teruk boleh dilihat dalam lengkung lebur.Bagaimana jika primer yang direka bentuk tidak dapat mengelakkan primer-dimer?
Kaedah 3: Kurangkan jumlah primer dan tingkatkan suhu penyepuhlindapan (tidak perlu dijelaskan).
Nilai empirikal suhu penyepuhlindapan ialah 60°C.Jika anda tidak pasti, bagaimana untuk memilih suhu penyepuhlindapan yang lebih sesuai?Jawapannya adalah sama dengan pilihan kepekatan primer -ujian kecerunan.Ambil gambar dari syarikat Bio-rad untuk menggambarkan masalah.Untuk penguatan serpihan sasaran tertentu, tetapkan lapan kecerunan suhu, setiap satu dengan tiga ulangan, dan lengkung penguatan yang diperoleh adalah seperti berikut:

pemilihan suhu penyepuhlindapan:
·70°C, 69°C—Pada asasnya, primer tidak boleh digabungkan, jadi tiada penguatan.
·67.3°C – Terdapat sedikit penguatan pada permulaan, dan nilai Ct agak besar.
·64.5°C——Nilai Ct berkurangan.
·Pada 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C dan 55.0°C, nilai Ct pada asasnya cenderung stabil, tetapi nilai pendarfluor akhir adalah berbeza.
Bagaimana untuk memilih?Prinsip: Prinsip pertama ialah nilai Ct yang lebih tinggi.Untuk nilai Ct yang sama, pilih suhu penyepuhlindapan yang lebih tinggi untuk mengelakkan dimerisasi dan penguatan bukan khusus.Walaupun terdapat nilai pendarfluor yang lebih tinggi pada 55°C, mungkin terdapat dimer atau penguatan bukan khusus di dalamnya.
Tetapi jika anda bijak seperti anda, anda pasti akan berfikir: Secara logiknya, jika tindak balas PCR sangat spesifik, selagi kepekatan primer melebihi keperluan minimum, titik tinggi dan rendah tidak sepatutnya memberi kesan, sama seperti pewarna pendarfluor dan dNTP.Sesungguhnya, selagi suhu penyepuhlindapan dioptimumkan dengan betul, kesan kepekatan primer pada nilai Ct secara semula jadi akan diminimumkan.

Suhu penyepuhlindapan dioptimumkan dengan betul, dan kesan kepekatan primer pada CT akan diminimumkan
Struktur sekunder menjejaskan kecekapan amplifikasi
Mari ambil gambar dari Bio-rad untuk menggambarkan masalah tersebut.Ia juga mereka bentuk kecerunan suhu untuk menguatkan gen dengan struktur sekunder.

Struktur sekunder muncul
Ia boleh dilihat bahawa apabila kecerunan suhu berkurangan, produk mula muncul dan nilai Ct bergerak ke hadapan, mencapai nilai minimum pada 60.7°C, dan kemudian apabila kecerunan suhu berkurangan, nilai Ct menjadi lebih besar.Sebaliknya, apabila suhu meningkat, struktur sekunder terbuka dan kecekapan amplifikasi meningkat.Selepas mencapai suhu tertentu, meningkatkan suhu tidak dapat meningkatkan kecekapan amplifikasi.Kerana primer tidak boleh digabungkan secara stabil pada masa ini.Oleh itu,cari suhu dengan nilai Ct terendah, yang merupakan suhu terbaik untuk menguatkan templat struktur sekunder!Sudah tentu, orang bodoh mesti tahu bahawa jika tidak perlu, lebih baik menukar primer dan mengelakkan kawasan struktur sekunder.
5. Tahap permohonan
MIQE—Analisis Data

Analisis data terutamanya diberikan oleh instrumen PCR kuantitatif pendarfluor.Dalam artikel sebelum ini, banyak kerja analisis data telah dilakukan, seperti kawalan kosong, yang telah dijelaskan dalam reka bentuk eksperimen.Gen rujukan dalaman, nombor ulangan, dsb. telah dijelaskan., di sini kami menerangkan terutamanya penggunaan qPCR.
qPCR digunakan secara meluas, dan pengesahan eksperimen dan diagnosis asid nukleik adalah senario yang paling biasa digunakan.
kuantifikasi mutlak
Log (kepekatan awal) mempunyai hubungan linear dengan bilangan kitaran.Lengkung piawai boleh diambil daripada piawai dengan nombor salinan awal yang diketahui, iaitu, hubungan linear tindak balas penguatan boleh diperolehi.Mengikut nilai Ct sampel, kepekatan dalam sampel boleh dikira.Jumlah templat yang perlu disertakan.

Kaedah Pengiraan Kuantitatif Mutlak
Kuantifikasi mutlak mestilah berdasarkan keluk piawai.Untuk membuat lengkung piawai, piawai diperlukan.Biasanya, piawai adalah plasmid yang diperolehi dengan mengkloning gen sasaran.Mengapa ia plasmid?Kerana DNA plasmid bulat adalah yang paling stabil.Cairkan produk standard dalam 5 hingga 6 kecerunan mengikut nisbah penggandaan (pencairan 10 kali ganda), dan perhatikan keseragaman semasa mencairkan.Biarkan nilai Ct jatuh antara 15-30.

Penyediaan standard
Pada masa yang sama, sampel yang akan diuji juga harus dicairkan dengan sewajarnya (ingat faktor pencairan), dan nilai Ct juga harus jatuh antara 15-30.Produk standard + sampel yang akan diuji diletakkan pada mesin bersama-sama.Selepas larian, satu lengkung piawai dibuat dengan bahan piawai, dan sampel yang akan diuji dibawa ke dalam lengkung piawai untuk mengira kepekatan.
Kuantifikasi HBV virus Hepatitis B ialah kuantifikasi mutlak yang tipikal, yang boleh mengira nombor salinan virus dalam 1ml darah.
Pengiraan nombor salinan
Kepekatan sampel untuk diuji (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × faktor pencairan
Berat molekul sampel = bilangan bes × 324
Nombor salinan sampel yang akan diuji (salinan/ul) = kepekatan sampel yang akan diuji / berat molekul sampel × 6 × 1014

Kaedah pengiraan nombor salinan

Di atas adalah kaedah pengiraan untuk menentukan kuantiti.Ini adalah masalah matematik yang boleh diselesaikan selepas tamat sekolah menengah, dan masalah matematik biasanya diselesaikan oleh komputer.Kalau tak faham boleh datang berkomunikasi.
kuantifikasi relatif
Kuantifikasi relatif digunakan terutamanya dalam penyelidikan saintifik.Berapa banyak virus yang terdapat dalam 1ml darah, dan ia adalah virus DNA, ini adalah peristiwa yang agak menentukan: jumlah darah boleh ditentukan, dan virus DNA agak stabil.Walau bagaimanapun, sukar bagi kita untuk membandingkan bilangan salinan transkripsi gen tertentu dalam daun, kerana sukar untuk menentukan saiz, berat dan kelembutan daun, jumlah RNA yang diekstrak sukar ditentukan, dan kecekapan transkripsi terbalik juga sukar untuk ditentukan, iaitu, sebarang langkah boleh menjadikan data eksperimen mempunyai pepijat dan tidak boleh digunakan.
Oleh itu, kuantifikasi relatif mesti memperkenalkan elemen:gen rujukan dalaman.
Dalam erti kata lain, kuantifikasi relatif sebenarnya adalah perbandingan antara gen sasaran dan gen rujukan dalaman.Berbanding dalam tisu yang sama dan sel yang sama, pengaruh saiz sampel, jumlah pengekstrakan RNA, kecekapan transkripsi terbalik, dan kecekapan PCR adalah agak kecil.Oleh kerana saiz sampel yang kecil, kedua-dua gen rujukan dalaman dan gen sasaran agak berkurangan.Inilah sebabnya kami telah menekankan keseragaman dan kestabilan sebelum ini.
Gen rujukan dalaman secara amnyagen pengemasan( gen house-keeping), yang merujuk kepada kelas gen yang dinyatakan secara stabil dalam semua sel, dan produknya diperlukan untuk mengekalkan aktiviti asas kehidupan sel.
Jangan kelirukan konsep ini.Gen pengemasan ialah istilah fungsi biologi, manakala gen rujukan dalaman ialah istilah teknikal percubaan.Gen pengemasan perlu lulus pengesahan sebelum ia boleh dipilih sebagai gen rujukan dalaman.
Sebagai contoh, kami memilih beberapa gen pengemasan dalam rajah di bawah untuk menguji tahap ekspresi mereka dalam sel tisu yang berbeza, dan mendapati bahawa tahap ekspresi β-2-mikroglobulin agak berbeza daripada tiga gen lain, jadi ia tidak boleh digunakan sebagai gen rujukan dalaman.

Selepas memahami fungsi pembetulan gen rujukan dalaman, dua algoritma diperoleh kerana pengenalan gen rujukan dalaman.
·kaedah lengkung piawai berganda
·2 – △△Kaedah Ct (kaedah perbandingan nilai CT)
Jika anda berminat untuk mengkaji spesies dan fungsi gen, sila tinggalkan penyelidikan tentang algoritma dan gunakan formula secara langsung, atau gunakan mesin secara langsung;jika anda seorang lelaki lurus dalam matematik dan kejuruteraan, sila berasa bebas.
kaedah lengkung piawai berganda
Kira gen sasaran dan gen pengemasan sampel kawalan dan sampel yang akan diuji melalui lengkung piawai, dan kemudian hitung nilai relatif mengikut formula pengiraan, iaitu tahap ekspresi relatif.
Kelebihan: analisis mudah, pengoptimuman percubaan yang agak mudah
Kelemahan: Untuk setiap gen, setiap pusingan eksperimen mesti membuat lengkung standard
Aplikasi: Salah satu daripada dua kaedah kuantitatif relatif yang paling biasa digunakan dan diiktiraf dalam kajian peraturan ekspresi gen
Formulanya adalah seperti berikut:

Contohnya adalah seperti berikut:

Kira jumlah relatif berdasarkan hasil kuantitatif
2 – △△Kaedah Ct (kaedah perbandingan nilai CT)

Kelebihan: Tidak perlu membuat lengkung standard
Kelemahan: Diandaikan bahawa kecekapan amplifikasi adalah hampir 100%;sisihan piawai adalah < 5%, dan lengkung piawai dan kecekapan antara setiap amplifikasi diandaikan konsisten;pengoptimuman keadaan eksperimen adalah lebih rumit.
Aplikasi: Salah satu daripada dua kaedah kuantitatif relatif yang paling biasa digunakan dan diiktiraf dalam kajian peraturan ekspresi gen

Sudah tentu, kecekapan amplifikasi biasanya mustahil untuk menjadi sempurna 1. Kaedah pembetulan: Jika kita tahu bahawa gen sasaran dan gen rujukan mempunyai kecekapan amplifikasi yang sama, tetapi kecekapan amplifikasi tidak bersamaan dengan 1, maka 2－△△Ct boleh diperbetulkan sebagai: (1+E )－△△Ct0.lifikasi sebagai contoh, jika rumusan Ct,l.9 yang betul, boleh diperbetulkan sebagai contoh: 1.95－△△Ct
Setakat ini, kandungan tentang PCR kuantitatif pendarfluor telah tamat .